Методы определения санитарно-показательных микроорганизмов воды, воздуха и почвы

Санитарно-бактериологическое исследование воды. Отбор проб воды. Точность результатов исследования воды зависит от способов отбора, хранения и перевозки проб воды в лабораторию для исследования, а также качества питательных сред, используемых при исследовании. Отбор проб воды производится специально подготовленным лицом (выемщиком проб, лаборантом или помощником санитарного врача) в присутствии представителя организации или учреждения, в ведении которого находится исследуемый водоисточник или водопроводное сооружение.

О выемке составляется акт, в котором указывают местонахождение и наименование сооружения, точки забора и дают краткую характеристику источника или сооружения. Указывают, по чьему заданию производится исследование, цель последнего, время забора (дата и час), должность и фамилия выемщика проб. Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Для этой цели используют емкости объемом 500 мл. Горлышко этой посуды должно быть заткнуто силиконовой, резиновой пробкой, обернуто бумажным колпачком и обвязано суровой ниткой. К колпачку привязывают стерильную корковую пробку, завернутую в бумагу. Сосуд, в который предстоит собрать пробу хлорированной воды, должен содержать 2 мл 1, 5% стерильного водного раствора гипосульфита (дехлоратора).

Кран, из которого отбирают воду для исследования, тщательно протирают тампоном, смоченным спиртом, и затем край обжигают. Эта процедура с особенной тщательностью должна производиться в пищеблоках, где в большинстве случаев краны водопровода сильно загрязнены. После стерилизации кран открывают до отказа и спускают воду. Из горлышка склянки над огнем вытаскивают ватно-марлевую пробку и в склянку набирают воду. Собрав около 400 мл воды, сосуд закупоривают корковой пробкой, освобождаемой от обертки, не прикасаясь при этом к пробке пальцами.

На сосуд наклеивают этикетку с указанием номера пробы или же надписывают номер карандашом по стеклу. Для перевозки в лабораторию посуду с пробами устанавливают в ящики типа контейнера, где температура должна поддерживаться в пределах 1-5°. Для этого закладывают в контейнер мешки из водонепроницаемой ткани, которые летом наполняют льдом, а зимой - теплой водой. Во время перевозки пробы следует предохранять от резких толчков, опрокидывания и замачивания пробок. В лабораторию они должны быть доставлены через такой промежуток времени, который позволил бы посеять воду не позднее чем через 2 часа с момента ее отбора,

В тех случаях, когда это требование не может быть выполнено, допускается проведение анализа воды не позднее чем через 6 часов с момента ее отбора, но при тщательном соблюдении температуры в пределах 1-5°.

Определение микробного числа. Для определения общего числа бактерий или, точнее, числа колоний засевают при исследовании чистых вод от 1 до 0, 1 мл. В пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды вносят 1 мл испытуемой воды и после тщательного перемешивания переносят в последующие пробирки с 9 мл стерильной воды по 1 мл предыдущего разведения до получения необходимых разведений. Из каждой пробы делают не менее двух посевов в количестве 1 мл воды непосредственно в стерильные чашки Петри. После внесения воды в каждую чашку вливают 8-10 мл расплавленного и остуженного до 45-49°питательного агара.

Для приготовления каждого разведения используют отдельную пипетку. Пипетка, которой набирают 1 мл разведенной воды, не должна погружаться в толщу слоя воды, приготовленной для получения последующего разведения. 1 мл испытуемой воды наслаивают на поверхность 9 мл стерильной воды, а не вносят в толщу воды в пробирке.

Посев не разведенной воды в объемах более 1 мл и менее 0, 1 мл не допускается. Для посева используют не менее двух различных разведений, выбор которых зависит от предполагаемой степени загрязненности воды. При этом рекомендуется так рассчитывать объем посевного материала, чтобы получить рост на чашках не менее 30 и не более 300 колоний.

Заведомо чистую воду, которая может дать рост менее 30 колоний на 1 чашке, засевают на 2 чашки по 1 мл. Выращивание посевов производят в термостате 24 часа при 37º С. Подсчету подлежат все выросшие на чашках колонии. При наличии роста на чашке более 300 колоний, в случае, если исследование не может быть повторено, допускается подсчет колоний на 74 см² площади чашки. В таких случаях в журнале исследований делается соответствующая запись. Подсчет выросших колоний производят с помощью лупы. Можно при этом также пользоваться счетными камерами Вольфгюгеля или Лафара.

В питьевой воде определяют общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМФ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37°С в течение 24 часов. Также определяют общие колиформные бактерии (ОКБ). ОКБ являются грамотрицательными, оксидазоотрицательными, не образующими спор палочками, которые способны расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37°С в течение 24-48 часов.

Определение количества бактерий — показателей фекального загрязнения. Показателями фекального загрязнения воды являются все разновидности кишечной палочки, обладающие следующими свойствами: грамотрицательная, неспороносная, короткая палочка, дающая на среде Эндо рост темно-красных с металлическим блеском или без него, розовых с темным центром или же бесцветных прозрачных колоний и сбраживающая глюкозу при 43 - 45° в течение 24 часов с образованием кислоты и газа.

Микробы выявляют: 1) методом титрования (бродильный метод); 2) методом мембранных фильтров с целью определения коли-индекса и коли-титра воды.

• Коли-титр воды - это ее наименьшее количество, в котором обнаруживается одна бактерия группы кишечных палочек (БГКП).

• Коли-индекс - количество БГКП в 1 л исследуемой воды.

Метод титрования. Производят посев различных объемов воды в глюкозо-пептонную среду Эйкмана (1% пептонная вода, 0, 5% раствор глюкозы, 0, 5% раствор хлорида натрия, индикатор Андреде и поплавок), причем для посевов больших количеств воды (100 и 10 мл) используют концентрированную среду, содержащую 10-ти кратные количества указанных веществ.

Исследованию подлежат следующие объемы воды:

а) из артезианских скважин и водопроводов - 300 мл (2 объема по 100 мл и 10 объемов по 10 мл),

для Москвы и Санкт-Петербурга - 500 мл (4 объема по 100 мл и 10 объемов по 10 мл);

б) из родников и из грунтовых колодцев - 111, 1 мл (100, 10, 1, 0, 1 мл);

в) из открытых водоемов (рек, озер, прудов) - 11, 11 мл (10, 1, 0, 1, 0, 001мл);

г) из сточной воды до очистки - 0.001 мл (0, 001, 0, 0001, 0, 00001 и 0, 000001 мл);

д) из сточной после очистки - 1, 11 мл (1, 0, 0, 1, 0, 01 и 0, 001 мл).

Для исследования водопроводной воды делают посевы трех объемов по 100 мл, трех объемов по 10 мл и трех объемов по 1 мл. Посевы инкубируют в течение 24 часов при 37°С. В случае положительного результата определяют помутнение среды, изменение цвета, появление газа в поплавке. Из положительных проб делают посев на среду Эндо. Из выросших колоний делают мазки, окрашивают по методу Грама и ставят оксидазный тест, позволяющий дифференцировать бактерии родов Escherichia, Citrobacter, Enterobacter (БГКП) от оксидазоположительных бактерий семейства Enterobactericeae, Pseudomonadaceae. При постановке оксидазного теста оксидазоотрицательные микроорганизмы не изменяют цвет тестовых полосок, а оксидазоположительные меняют цвет тест-полоски на синий. Коли-титр и коли-индекс определяется с помощью статистической таблицы (см. рабочую тетрадь).

Метод мембранных фильтров. Мембранный фильтр № 3 помещают в воронку Зейтца, вмонтированную в колбу Бунзена, которая присоединяется к вакуумному насосу. Мембранные фильтры предварительно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде. Воду из водопроводной сети и воду из артезианских скважин фильтруют в объеме 333 мл. Чистую воду открытого водоема фильтруют в объеме 100, 10, 1, 0 и 0, 1 мл, более загрязненную перед фильтрованием разводят стерильной водой. После окончания фильтрации фильтр стерильным пинцетом накладывают нижней стороной на поверхность среды Эндо в чашке Петри, избегая при этом образования пузырьков между средой и фильтром. После суточной инкубации при температуре 37°С подсчитывают количество колоний, выросших на мембранном фильтре типичных для БГКП. Из 2-3 колоний ярко-малинового цвета с характерным металлическим блеском готовят мазки, окрашивают по методу Грама и определяют оксидазную активность. БГКП представлены грамотрицательными одиночными палочками, не обладающими оксидазной активностью. Пересчетом этого числа на количество в 1 л воды определяют коли-индекс. Коли-титр вычисляют делением 1000 на число, выражающее, коли-индекс. Например, если коли-индекс равен 10, то коли-титр равен 1000: 10=100 мл.

Нормативы питьевой воды (ГОСТ 2874-82) – МИКРОБНОЕ ЧИСЛО НЕ БОЛЕЕ 100, ЧИСЛО БГКП (БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНЫХ ПАЛОЧЕК) В 1 МЛ ВОДЫ (коли-индекс) НЕ БОЛЕЕ 3 и (коли-титр) НЕ МЕНЕЕ 333.

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха. Количественные микробиологические методы исследования воздуха основаны на принципах осаждения (седиментации), аспирации или фильтрации.

Метод седиментации. Простейшим методом бактериологического исследования воздуха является метод оседания (Коха). Метод основывается на оседании бактериальных частиц и капель под влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. В атмосферном воздухе наряду с оседанием большое значение приобретает прибивающее действие ветра, при помощи которого крупные пылевые частицы прибиваются к поверхности агара. Чашки с мясо-пептонным агаром экспонируются 5 - 10 - 15 минут в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения. Экспозиция чашек с элективными средами, увеличивается до 30 минут - 1 часа. Однако метод оседания не дает количественного представления о содержании микрофлоры в воздухе, так как на открытых чашках плохо улавливаются тонкодисперсные фракции бактериальных капель и пылевых частиц. На чашках Петри улавливаются главным образом крупные пылевые частицы, оседающие в закрытых помещениях, или же крупные частицы пыли и почвы, которые оседают или прибиваются ветром к поверхности среды из атмосферного воздуха. Поэтому метод оседания может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют другие, более совершенные приборы и методы или же когда нет электроэнергии.

Чашечный метод. Чашки Петри с мясо-пептонным агаром или со специальной средой для патогенных стафилококков, стрептококков кровяной МПА устанавливают в открытом виде на различной высоте от пола. В среднем рекомендуют отбирать одну пробу на каждые 20 м2 помещения. Срок экспозиции зависит от предполагаемого количества микробов в воздухе. При большом количестве микроорганизмов чашки открывают на 5-10 минут, при малом - на 20 - 40 минут.

Посевы помещают в термостат при 37° на 24 часа и дополнительно выдерживают 48 часов на рассеянном свету при комнатной температуре, после чего производят подсчет колоний и изучают характер микрофлоры.

Зная, что по данным В. Л. Омелянского, на поверхность среды площадью в 100 см² оседает за 5 минут столько микробов, сколько их содержится в 10 л воздуха, можно определить микробное число. Например, на чашке с мясо-пептонным агаром при 5-минутной экспозиции выросло 32 колонии, следует вычислить количество микробов, находящихся в 1 м³ применяя формулу Омелянского. Зная площадь чашки и количество выросших колоний можно определить какое количество микробов (Х) выросло бы при данной экспозиции на поверхности среды в 100 см². Имеется специальная таблица расчета для определения общего количества микробов в 1 м³ воздуха.

Если в чашке с мясо-пептонным агаром площадью 78, 5 см² при 10-минутной экспозиции выросло 40 колонии, то количество микробов в 1 м³ воздуха будет равно 40 × 60 = 2400.

Множитель соответствует кратности увеличенной экспозиции. Приведенные расчеты используют и для количественного определения болезнетворных бактерий в воздухе (стафилококки, стрептококки и др.).

Аспирационный метод основан на ударном действии воздушной струи о поверхность питательной среды. Для исследования воздуха этим методом применяют аспирационный прибор Кротова. Воздух в количестве 50—100 л пропускают со скоростью 25 л в минуту над открытой чашкой с мясо-нептонным агаром или со специальной средой. На намеченной точке отбора проб аппарат включают в электросеть, снимают крышку и устанавливают открытую чашку с питательной средой. Рукой сообщают ей движение по особой стрелке, закрывают крышку аппарата и включают прибор. Воздух поступает через клиновидную щель и с силой ударяется о поверхность питательной среды, на которой фиксируются микробы. Вращение столика с чашкой Петри обеспечивает равномерное распределение микроорганизмов по всей поверхности питательной среды. К концу заданного времени чашку с посевом воздуха снимают, закрывают ее и помещают в термостат. Допустим, на чашке при подсчете обнаружено 250 колоний, воздух пропускали 2 минуты со скоростью 25 л в минуту. Всего было пропущено 50 л воздуха.

В качестве временных норм для лечебно-профилактических учреждений пользуются следующими показателями санитарно-гигиенического состояния воздуха: в хирургических операционных общее количество микробов до начала операции допускается не выше 500 в 1м², после операции - 1000. В предоперационных и перевязочных комнатах предельная норма микробов до начала работы 750 микробов в 1м³, после работы - 1500. В родильных палатах общее количество микробов допускается до 2000 в 1 м³ воздуха, стафилококков и стрептококков - не выше 24 в 1 м³, а в комнатах новорожденных - 44 в 1 м³. В остальных больничных помещениях в зависимости от количества патогенных кокков и общего количества микробов в 1 м² различают чистый, слабо загрязненный и загрязненный воздух. Допустимых норм санитарно-гигиенического состояния воздуха в жилых помещениях пока не имеется. В таких помещениях рекомендуют проводить исследование воздуха в разное время дня (до и после ухода на работу и т. д.). Качество уборки и дезинфекции оценивают по результатам бактериологического исследования воздуха до и после этих операций.

Санитарно-бактериологическое исследование почвы. Отбор проб почвы. Почву берут на глубине 10-15 см стерильным ножом (из разных мест исследуемой территории не менее 10 проб) и помещают в стерильную банку. Из проб готовят навеску (30 г), которую вносят в колбу с водой (270 мл) и тщательно встряхивают. Из полученной суспензии готовят разведения 10^-3, 10^-4, 10^-5. Из двух последних разведений берут по 0, 1 мл и смешивают с 4, 0 мл 0, 7% расплавленного и остуженного до 45°С питательного агара, после чего выливают вторым слоем в чашки Петри с 2% питательным агаром. Посевы инкубируют при 37°С, затем подсчитывают количество выросших колоний и определяют микробное число.

Определение общего числа бактерий. Из каждой пробы почвы должно быть использовано для посева не менее двух различных разведении в зависимости от степени предполагаемого загрязнения исследуемой почвы. Перед посевом каждое разведение в пробирках тщательно перемешивают стерильной пипеткой, после чего из него отбирают 1 мл суспензии и переносят на дно стерильной чашки Петри под слегка приподнятую крышку.

Из каждого разведения должен быть сделан одновременно посев минимум в 2 чашки. После посева в каждую чашку вливают 15 мл предварительно расплавленного и остуженного до 45° питательного агара. Расплавленный агар в чашках Петри хорошо перемешивают с имеющейся в них взвесью почвы, осторожно наклоняя чашку во все стороны для равномерного распределения питательной среды по дну чашки Петри, последнюю ставят на горизонтальную поверхность до застывания агара. На крышке чашки помечает номер пробы и разведение.

После застывания агара, чашки с посевом в перевернутом виде (крышкой вниз) помещают на 48 часов в термостат, настроенный на 28-30°С. Если выращивание производят при более низкой температуре, например 22°С, срок инкубации должен быть увеличен до 72 часов. После инкубации посевов подсчитывают количество выросших колоний. Для подсчета бактерий необходимо брать такие разведения, при которых на чашках вырастает от 50 до 150 колоний. Если на чашках выросло больше 150 колоний и нет других разведений, допускается подсчет колоний на 1/4 чашки с пересчетом на всю ее площадь. Из суммы колоний, выросших на 2 чашках, выводят среднеарифметическое число и затем пересчитывают число колоний на 1 г почвы.

Пример. Посеян 1 мл почвенной суспензии из разведения 1: 10000. На всей площади чашки выросло 80 колоний. Это число надо помножить на степень разведения (10000). Получаем, что в 1 г почвы содержится 800 000 бактерий (8*10⁵). Санитарное значение числа сапрофитных бактерий в почве нельзя рассматривать без учета особенностей типа почвы.

Определение количества кишечной палочки. Санитарную оценку почвы при фекальном загрязнении необходимо проводить, пользуясь определением не только типичной кишечной палочки, но и всех ее разновидностей, способных вызвать газообразование на жидких средах с глюкозой при 43 - 45°С. Бактерии, относящиеся к этой группе, характеризуются следующими признаками: короткие грамотрицательные неспороносные палочки; аэробы или факультативные анаэробы, способные вызвать сбраживание глюкозы с образованием кислоты и газа в течение 24 часов при 43°С.

Наличие кишечной палочки выявляют посевом различных количеств почвы в бродильные сосуды с модифицированной средой Кесслера-Свенертона (бродильная проба, первый этап). При анализе чистых почв посев производят от 10 мл почвенной суспензии основного разведения от 1: 10 до 1: 1000. При работе с загрязненными почвами используют разведения до 1: 1000 000. Из исходного разведения (1: 10) стерильной пипеткой берут 10 мл и засевают в колбу с 50 мл среды Кесслера - Свенертона, что соответствует 1 г почвы. Посев меньших количеств делают, но 1 мл из соответствующих разведении почвенной суспензии в пробирки с 9 мл той же среды.

Посевы выращивают в термостате при 43°С (при отсутствии термостата на 43°С можно выращивать при 37°С). В случае задержки роста посев оставляют в термостате еще на сутки. При отсутствии через 18-24 часа газообразования и помутнения в бродильных сосудах выдают окончательный ответ об отсутствии бактерий группы кишечной палочки. При наличии в сосудах с питательной средой газообразования и мути или одной только мути производят высев на среду Эндо или на розоловый дифференциальный агар. Посевного материала надо брать мало, чтобы получить изолированные колонии (посев на элективные среды, второй этап),

Чашки с посевом помещают в термостат (крышкой вниз) на 24 часа при 37°С При отсутствии роста на чашках выдают окончательный отрицательный ответ. При наличии колоний, типичных для кишечной палочки (темно-красные с металлическим блеском и бесцветные колонии на среде Эндо или желтые и оранжевые колонии на розоловой среде), из них готовят мазки, окрашивают по Граму и исследуют под микроскопом. Обнаружение в мазках грамотрицательных коротких неспороносных палочек указывает на необходимость перехода к третьему этапу анализа. Отбирают колонии, выросшие на плотной элективной среде, производят посев на глюкозо-пептонную среду и помещают в термостат на 24 часа при 43°С. При появлении газообразования выдают окончательный положительный ответ о наличии кишечной палочки (вторичная бродильная проба, третий этап).

Обнаружение протеев. При исследовании почвы на наличие в ней протеев приготовляют разведения из основной почвенной суспензии вплоть до 1: 10000. Из каждого разведения стерильной пипеткой берут 1 мл суспензии и вносят в конденсационную воду свежескошенного мясо-пептонного агара (по методу Шукевича). При этом поверхность питательной среды не должна загрязняться вносимой почвой. Пробирки ставят в термостат при 37°С. Через 24 - 48 часов рост протеев обнаруживают в виде тонкой вуалеобразной пленки на поверхности агара.

Обнаружение сальмонелл и шигелл. Для исследования используют навеску почвы весом не менее 30 - 50 г. Посев почвы производят из основного разведения ее 1: 10 в стерильной водопроводной воде.

Почвенную суспензию после ее приготовления и последующего отстаивания около одной минуты осторожно сливают с осевшего осадка в другой стерильный сосуд для освобождения от грубых механических примесей.

Для концентрации микробов к 500 мл взвеси почвы добавляют 2 мл 10% стерильного раствора соды (Nа₂СО₃) и затем 1, 7 мл 10% стерильного раствора сернокислой окиси размешивают и оставляют на холоде на 1 час. Образовавшиеся после коагуляции хлопья оседают на дно сосуда вместе с частицами почвы и бактериями. Осадок вместе с оставшейся жидкостью центрифугируют в течение 5 минут, после чего прозрачную жидкость над осадком сливают, а осадок растворяют в стерильном растворе виннокаменнокислого калия.

Осадок после коагуляции засевают по 0, 5 - 1 мл на две плотные элективные среды: Плоскирева и Вильсона - Блера. Для получения изолированных колоний на чашке со средой производят рассев внесенного в чашку осадка с помощью стерильного шпателя. Этим же шпателем заражают поверхность среды 3 - 4 чашек. Такой рассев позволяет получить изолированные колонии. Оставшийся осадок почвенной суспензии засевают в одну из сред обогащения. Посевы выращивают в термостате при 37°С.

Дальнейшее изучение морфологических, ферментативных и серологических свойств выделенных культур проводят по общепринятой методике. Для исследования почвы на присутствие в ней представителей сальмонелл и шигелл целесообразно производить концентрацию микробов на мембранных фильтрах. Взвесь почвы фильтруют через предварительный планктонный фильтр. Этим задерживается значительная часть грубых механических примесей (обладающих слабой поглотительной способностью по отношению к бактериям) и создается возможность фильтрации суспензии через мембранные фильтры № 3. Мембранные фильтры подготовляют к анализам, как уже было указано ранее. На фильтровальную пластинку прибора Гольдмана - Зейтца накладывают мембранный фильтр № 3 и сверху накрывают предварительным мембранным фильтром.

Если исследуемая почва содержит небольшое количество мелких и илистых частиц, то через фильтр можно пропустить до 20 мл суспензии. При большом содержании мелких и илистых частиц фильтрация затрудняется. В этих случаях взвесь почвы следует фильтровать небольшими объемами до 5 мл через 2 - 3 мембранных фильтра. Осевшие на мембранных фильтрах мелкие коллоидальные частицы почвы задерживают одновременно микробы.

Каждый мембранный фильтр накладывают на чашку с дифференциальной средой и размазывают осадок с фильтра по всей чашке. Рассев на питательную среду производят стерильным шпателем. Если почва отфильтрована через несколько фильтров, то в пределах одной пробы шпатель можно переносить с одного фильтра на другой без стерилизации. Тем же пистолем без обжигания делают посевы на 2 - 3 дополнительные чашки с дифференциальной средой (розоловый или висмут-сульфитный агар и среду Плоскирева) для получения изолированных колоний. Посевы выращивают в термостате при 37°С.

Результаты бактериологического исследования почвы выражаются коли-титром, перфрингенс-титром и титром термофильных бактерий почвы.

Определение титра анаэробов. Для определения Cl. рerfringens в почве при бактериологических анализах используют железо-сульфитный агар (среда Вильсона—Блера). Посев почвы производят из тех же разведений почвенной суспензии, что для определения коли-титра. Для освобождения от неспороносной микрофлоры все посевы с разведениями основной почвенной суспензии прогревают при 80° в течение 15 минут. Из соответствующего разведения берут стерильной пипеткой 1 мл и вносят в пробирку с расплавленной и охлажденной примерно до 45°С агаровой средой. Вращением пробирки между ладонями равномерно распределяют материал в питательном агаре. Посевы выращивают в термостате при 37°С, а лучше при 43°С. Появление в течение первых 18 часов роста в глубине агара черных колоний, нередко разрывающих среду вследствие газообразования, указывает на наличие C. рerfringens. Черное окрашивание среды зависит от восстановления бактериями сульфата натрия до сернистого натрия (Na₂S), который, взаимодействуя с хлорным железом, образует черное сернистое железо (FeS). Предельное разведение почвенной суспензии, которое дает развитие колоний C. рerfringens, показывает титр этого микроба. Для более простой и быстрой индикации C. рerfringens в почве рекомендуется применять посевы исследуемого материала в стерильное молоко - 1 мл каждого разведения почвенной суспензии засевают в пробирки с молоком, разлитым по 5 мл в каждую. В дальнейшем поступают с посевами, как описано выше: прогревают, выращивают в термостате. Наличие C. рerfringens регистрируют по наступившему свертыванию молока с полным отделением сыворотки и выбрасыванию губчатого свертка на поверхность в связи с энергичным газообразованием. Присутствие C. рerfringens подтверждается бактериоскопически нахождением в мазках из содержимого пробирок типичных крупных толстых грамположительных палочек. Предельное разведение почвенной суспензии, которое дает на молочной среде развитие колоний C. рerfringens, показывает титр этого микроба в почве.

Исследование почвы на наличие C. tetani. Пробы почвы собираются в стерильную баночку в количестве 20 - 30 г. Всю собранную почву переносят в стерильную фарфоровую ступку. После тщательного измельчения и перемешивания фарфоровым пестиком небольшую порцию почвы в количестве 3 - 5 г разводят в 8 - 15 мл стерильного физиологического раствора. Полученную взвесь после 3 - 4 часового отстаивания при комнатной температуре вводят белым мышам под кожу правой задней конечности в количестве 1 мл. Перед введением пробирку со взвесью слегка встряхивают. Каждую пробу испытывают на 2 мышах. Одновременно ставят контрольный опыт на мышах, которым предварительно перед введением взвеси почвы была введена противостолбнячная сыворотка.

Гибель первой группы животных с характерными симптомами и выживание контрольных мышей указывает на наличие C. tetani в исследуемых объектах.

Посев производят из суспензии почвы в колбочку с сахарным бульоном. В дальнейшем анализ проводится по общей методике выделения клостридий.

Исследование почвы на наличие C. botulum. Две навески почвы по 20 - 30 г растирают в стерильной фарфоровой ступке и вносят в колбу с 80 - 100 мл среды Тароцци. Одну из этих колб с посевом почвы прогревают при 80° в течение 30 минут для уничтожения неспороносных микробов. Обе колбы с посевом (прогретым и непрогретым) ставят в термостат при 37°С. Через 8 - 14 дней из среды обогащения производят высев в агар столбиком или на чашки с сахарным кровяным агаром и в дальнейшем изучают биологические и антигенные свойства полученных культур по методам, описанным для выделения клостридий. Для обнаружения токсина следует пользоваться биологической пробой: 0, 5 мл исследуемой жидкости впрыскивают 2 мышам под кожу или внутримышечно. В качестве контроля 2 мышам вводят прогретую исследуемую жидкость, а еще 2 мышам - непрогретую жидкость в смеси с антиботулинической поливалентной сывороткой. Если мыши, которым ввели непрогретую жидкость, погибают через 1—4 суток, а контрольные мыши остаются живы, то результаты биологической пробы на присутствие токсина Cl. Botulum. считаются положительными.

Титр БГКП и перфрингенс-титр для сильно загрязненных почв — соответственно 0, 009 и ни­же, 0, 00009 и ниже; для чистых почв — коли-титр 1, 0 и выше, перфрингенс-титр — 0, 01 и выше.

Количество термофилов (на 1 г почвы; культивирование при температуре 60°С): в чистых почвах — 100-1000, в загрязнен­ных— 1000—10 000, а в сильно загрязнен­ных— 100 000-400 000 колониеобразующих единиц (КОЕ).

III. План практической работы

1. Определить коли-индекс воды:

а) бродильным методом

б) методом мембранных фильтров

2. Определить микрофлору воздуха:

а) седиментационным методом

б) аспирационным методом

3. Определить ОМЧ воды, воздуха и почвы

4. Интерпретировать анализы микрофлоры кишечника на дисбактериоз

5. Заполнить таблицу по теме занятия

6. Решить ситуационные задачи