Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Методы заражения животных. Дозы, определяющие вирулентность, зависят не толь­ко от вида и штамма микроорганизма, но и от вида и возраста подопытного животного, а также от способа заражения. Поэтому для получения сравнимых ре­зультатов исследования проводят на животных одного вида, пола и массы. При работе с бактериями использу­ют 18—24-часовую культуру, так как в более старых культурах присутствует много погибших клеток. Лабораторных животных используют также для:

1. вы­деления микроорганизмов из исследуемого материала, особенно в тех случаях, когда возбудитель не может быть обнаружен методом посева, например при вирус­ных заболеваниях, риккетсиозах и др.;

2. для выделения чистой культуры патогенного микроорганизма из мате­риала, загрязненного другими микроорганизмами;

3. для изучения действия микробных токсинов (определение DLM-токсина, определение дермонекротического дейст­вия и т. д.);

4. для экспериментального воспроизведения некоторых инфекций. Последнее часто используют для изучения эффективности антибиотиков, химиотерапевтических и иммунобиологических препаратов.

При выборе вида лабораторного животного необходимо учитывать степень его восприимчивости к изучаемому возбудителю инфекции.

Для экспериментального заражения чаще использу­ют белых мышей, крыс, морских свинок и кроликов. Для некоторых специальных исследований служат обезьяны, кошки, собаки, лошади, крупный и мелкий рогатый скот, дикие животные (хомяки, суслики, дикие крысы, полев­ки), птицы (куры, голуби и т. д.), а также куриные эм­брионы. Перед опытом животных взвешивают, марки­руют, при проведении некоторых опытов термометрируют. При манипуляциях с животными их иммобилизуют с помощью специальных приспособлений или фиксируют мелких животных руками, работая с помощником или без него. Инструменты, предназначенные для работы с животными, стерилизуют кипячением.

Существуют следующие способы заражения: подкож­ный, внутрикожный, накожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, пероральный (через рот), интраназальный (через нос в дыхательный тракт), вве­дение в глаз, введение в центральную нервную систему. При внутрикожном или накожном способе зара­жения шерсть на месте введения или нанесения материа­ла удаляют выстриганием, выщипыванием или депилированием.

Вскрытие и микробиологическое исследование погиб­ших животных. Вскрытие следует производить непосред­ственно после гибели животного, чтобы избежать про­никновения микроорганизмов из кишечника в кровь и другие органы. При отсутствии такой возможности тру­пы сохраняют на холоде. Вскрытие производят на спе­циальном столе в отдельной комнате. На столе должно находиться все необходимое для вскрытия и бактерио­логического исследования секционного материала: доска или кювета, залитая парафином, — для фиксации живот­ного, газовая горелка или спиртовка, сосуд со спиртом и ватой на дне, в котором находятся простерилизованные инструменты (ножницы, скальпель, хирургический и анатомический пинцеты и пр.), стерильные ватные тампоны, бактериальная петля, стерильные пастеровские пипетки, предметные стекла, чашки Петри, пробирки с питательными средами. Выбор сред зависит от вида микроорганизма, который считают причиной гибели жи­вотного.

Все наблюдения, сделанные во время вскрытия, про­токолируют. Отмечают вид животного, номер, время и место заражения, материал, применяемый для зараже­ния, время гибели, обнаруженные изменения и т. д. Во время вскрытия необходимо следить за тем, чтобы жид­кость и кусочки тканей и органов не попали на стол. После каждой манипуляции инструменты промывают водой или спиртом и прожигают.

Вскрытие состоит из следующих этапов: 1) фиксация животного; 2) осмотр наружных покровов; 3) вскрытие; 4) ис­следование грудной полости; 5) вскрытие и исследование брюшной полости.

Отмечают цвет, величину и консис­тенцию каждого органа. Из измененных органов (или из всех, в зависимости от цели эксперимента) делают высев на питательные среды, мазки и мазки-отпечатки. Для посева прижженную поверхность органа надрезают сте­рильным скальпелем, из глубины органа вырезают ма­ленький кусочек, часть его помещают в питательную среду, а из другой делают мазки-отпечатки, приклады­вая срезанную часть к стеклу. Обязательно делают по­сев крови из сердца. Для этого прижигают раскаленным скальпелем верхушку сердца и стерильной пастеровской пипеткой прокалывают прожженный участок, кровь при этом поднимается в капилляр. Кровь из капилля­ра выдувают в питательные среды и делают из нее мазки.

После окончания вскрытия производят тщательную уборку рабочего места. Труп животного сжигают или автоклавируют. Инструменты стерилизуют кипячением или автоклавируют. Доску или кювету протирают спиртом и прожигают или заливают на сутки дезинфицирую­щим раствором. Мазки фиксируют в пламени или жид­ким фиксатором, окрашивают и изучают.

III. План практической работы

1. Провести обнаружение бактериальных структур, являющихся факторами патогенности

а) капсулы бактерий в готовых мазках

См. Модуль I «Морфология микроорганизмов», окраска по Бурри-Гинсу

б) жгутиков бактерий – зарисовать различные варианты расположения жгутиков (монотрих, лофотрих, амфитрих, перитрих).

См. Модуль I «Морфология микроорганизмов»

в) корд-фактора у патогенных микобактерий

При культивировании микобактерий на предметных стеклах, погруженных в жидкую среду на основе цитратной крови, микроколонии вирулентных штаммов вырастают в виде переплетающихся кос – тяжей, вследствие наличия корд-фактора. Для их обнаружения стекла окрашивают по методу Циля-Нильсена и проводят иммерсионную микроскопию (метод микрокультивирования по Прайсу).

2. Учесть результаты определения факторов патогенности стафилококка: гемолизина, лецитиназы и плазмокоагулазы.

Гемолизин (экзофермент, по механизму действия мембранотоксин) определяют путем посева испытуемой культуры на чашки Петри с кровяным агаром. Посевы инкубирую при 37°С в течение 24 часов. Вокруг колоний гемолитических микроорганизмов образуются зоны полного (β) или неполного, зеленящего (ά) гемолиза.

Для обнаружения лецитиназы производят посев исследуемой культуры на питательный агар с лецитином (желточный агар). Вокруг колоний бактерий, выделяющих фермент, образуется зона помутнения с перламутровым блеском.

Плазмокоагулаза выявляется при посеве испытуемой культуры в 0, 4 мл стерильной цитратной плазмы крови. Посевы инкубируют при 37°С в течение 2-5 ч. В случае образования фермента происходит свертывание плазмы (образование геля), а в контроле она остается жидкой (золь).

3. Учесть результаты определения токсигенности дифтерийной палочки, зарисовать.

См. Модуль IV «Общая и прикладная иммунология», виды реакции преципитации

4. Зарисовать схему этапов проведения биологического метода диагностики инфекционных заболеваний.

5. Заполнить таблицы по теме занятия

6. Решить ситуационные задачи

УИРС Учесть результаты чувствительности микрофлоры зева к антибактериальным препаратам, заполнить таблицу.