Определение окислительно-восстановительных ферментов бактерий

Изучение сахаролитических и протеолитических ферментов часто оказывается достаточным для определения вида, но в некоторых случаях возникает необходимость включать в изучение другие ферменты: уреазу, каталазу, цитохромоксидазу, нитратредуктазу и др.

Тест на уреазу. Наличие уреазы определяют на среде с мочевиной и индикатором фенолротом (начальный цвет среды-желтый). При расщеплении моче­вины на аммиак и углекислый газ накапливается аммоний, что сдвигает рН в щелочную сторону и изменяет цвет индикатора в красный.

Тест на нитратредуктазную активность. Этот тест используют для идентификации отдельных видов бактерий. Он позволяет опреде­лить способность восстанавливать нитраты в нитриты. Выявление нитратредуктазы (фермента восстанавливающий нитраты в нитриты) характерно в основном для факультатив­ных анаэробов. Способность к восстановлению NO₃ в N0₂, определяют культивированием в МПБ, содержащем 1% раствор KNO₃. Для определения нитритов в среду добавляют несколько капель реактива Грисса, содержащий уксусную кислоту. По­явление красного окрашивания свидетельствует о нали­чии нитритов.

Тест на каталазу. Каталаза — это фермент, катализирующий реакцию разложения перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталазу содержат аэробы и факультативные анаэробы, но она отсутствует у облигатных анаэробов, на которых перекись водорода оказывает губительное действие. Бактериологическую петлю исследуемой культуры с плотной питательной среды суспезируют в капле 3% раствора перекиси водорода на предметном стекле. Образование пузырьков газа свидетельствует о проявлении каталазной активности.

Тест на оксидазу (цитохромоксидазу). Цитохромоксидаза — это фермент, обеспечивающий перенос электронов на кислород в процессе аэробного дыхания. Активность цитохромоксидазы учитывают при дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae и др. Обнаружение цитохромоксидазы у аэробов проводится путем нане­сения и растирания петли культуры на индикаторную бумажку, пропитан­ную спиртовым раствором альфа-нафтола и 1% водным раствором мен­тола. О наличии цитохромоксидазы судят по синему окрашиванию, появ­ляющемуся через 2—5 мин.

Тест на плазмокоагулазную активность. Плазмокоагулаза - фермент, свертывающий плазму крови животных. Петлю агаровой культуры стафилококка суспензируют в 0, 5 мл цитратной кроличьей плазме, разведенной 1: 5. Результаты регистрируют через 1, 2, 4 и 18 часов инкубации проб в термостате при температуре 37°С. Появление на дне пробирки студнеобразного сгустка свидетельствует о наличии плазмокоагулазы.

Тест на гемолитическую активность. Определяется при посеве испытуемых микроорганизмов на кровяной агар. Гемолитическая активность характеризуется появлением зоны просветления среды вокруг колоний.Различают β -гемолиз (полный гемолиз), когда образуются зоны просветления вокруг колоний, α -гемолиз или неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как γ -гемолиз.

При идентификации многих микроорганизмов исполь­зуют реакцию Фогеса — Проскауэра на ацетоин — проме­жуточное соединение при образовании бутандиола из пировиноградной кислоты. Положительная реакция свиде­тельствует о наличии бутандиолового брожения. Определение образования ацетона проводится при добавлении к культуре 40% КОН и 5% альфа-нафто­ла. При наличии ацетоина жидкость приобретает красное окрашивание, т.е. в щелочных условиях ацетон образует с альфа-нафтолом соединение красного цвета - ацетилметилкарбинол.