Лекция 16

Дизайн ЛВ, взаимодействующих с ДНК

Строение и функции ДНК

Геном. Функциональная геномика. Хемогеномика

Мутации ДНК. Активные центры. ДНК как биомишень для ЛВ

Противораковые ЛВ-алкилаторы

Дизайн антигерпесных ЛВ группы ацикловира, действующих на уровне репликации ДНК

Противораковые интеркаляторы. Метоксипсорален

Строение и функции ДНК

Макромолекулы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) входят в состав каждой живой клетки. В 1944 г было открыто, что в них хранится вся наследственная информация. Механизм передачи наследственных признаков в живых организмах от родителей к их потомству был открыт в 1953 году. Было установлено, что в зашифровке (кодировании), хранении и передаче (декодировании) наследственных признаков и всей биологической информации участвуют производные двух групп азотистых гетероциклов – пиримидина и пурина: цитозин, тимин, аденин и гуанин, которые содержатся в огромных молекулах ДНК, имеющих молекулярную массу до нескольких миллионов:

Наряду с ДНК в клетках находятся и представители другого типа нуклеиновых (т.е., находящихся в ядрах клеток, от лат. нуклеус- ядро) кислот- рибонуклеиновые кислоты (РНК). Их основная функция - обеспечение синтеза надлежащих белков - носителей жизни. “Записанный” в РНК код, определяющий аминокислотную последовательность в белках, передаётся рибонуклеиновой кислоте от ДНК. В этом смысле РНК имеет подчинённое по отношению к ДНК значение.

Рассмотрим первичную структуру ДНК. Под нею подразумевается состав входящих в них компонентов и характер их соединения друг с другом. Полный гидролиз ДНК приводит к образованию трёх видов веществ: фосфорной кислоты, сахара-пентозы и перечисленных выше азотистых оснований. Здесь выявляется два существенных отличия РНК от ДНК. В молекулах РНК вместо тимина присутствует урацил, а в качестве сахарной компоненты - D-рибоза (в ДНК - 2-дезокси-D-рибоза). Обе рибозы существуют в НК не в линейной, а в циклической полуацетальной форме в виде пятичленного фуранозного кольца, а не шестичленного пиранозного не смотря на то, что фуранозная форма менее устойчива из-за большей напряжённости валентных углов в пятичленном цикле:

β -D-рибопираноза α -D-рибопираноза β -D-рибофураноза α -D-рибофураноза

Находящийся при атоме С-1 гидроксил называется полуацетальным. Он может занимать два различных положения относительно плоскости кольца, т.е. быть как бы снизу или сверху от неё. В зависимости от этого фуранозная форма имеет α - и β -модификации. Рибоза находится в нуклеиновых кислотах исключительно в виде β -D-рибофуранозы, т.к. лишь эта конфигурация обеспечивает построение протяжённой и достаточно устойчивой с точки зрения электронных и геометрических факторов спиральной полимерной цепи вторичной структуры. Фрагмент такой цепи показан на рис.10.1:

Рис.10.1. 3^' - 5^' -Фосфодиэфирная связь между нуклеотидами и полинуклеотидный участок цепи ДНК

Исследование первичной структуры ДНК и РНК - это прежде всего установление последовательности чередования гетероциклических оснований. Первые успешные попытки секвенирования НК (т.е. установления такой последовательности) были осуществлены в 1960-е годы. В настоящее время имеются надёжные методы определения такой последовательности. Более того - разработаны методы направленного синтеза полинуклеотидов, в том числе с помощью автоматического робота- синтезатора, который по специально заданной компьютерной программе осуществляет сборку больших фрагментов нуклеиновых кислот из моно-, ди- и олигонуклеотидов.

При изучении пространственной вторичной структуры ДНК было установлено, что она образует не просто спиральную структуру, как в случае белков, а двойную спираль, в которой участвуют две молекулы ДНК. Ниже приведены основные характеристики вторичной структуры ДНК: 1. Молекула ДНК состоит из двух скрученных правосторонних полинуклеотидных спиралей. Спирали антипараллельны друг другу (т.е., если двигаться вдоль них в одном направлении, то в одной спирали последовательность связей в углеводофосфатной цепи будет –5^', 3^'-5^', 3^'-5', 3^'–, тогда как в другой –3^', 5^'-3^', 5'-3^', 5^'–).

2. Пуриновые и пиримидиновые основания находятся внутри двойной спирали и плоскости их колец практически перпендикулярны её главной оси. Наоборот, плоскости пентозных колец в углеводофосфатном остове примерно параллельны главной оси спирали.

3. Полный виток спирали имеет в длину 34 Ǻ и включает 10 нуклеотидных пар. Расстояние между плоскостями соседних гетероциклических оснований в цепи составляет 3, 4 Ǻ.

4. Наиболее существенным для вторичной структуры ДНК является механизм сцепления двух спиралей. Его обеспечивают сразу несколько типов невалентных взаимодействий. Прежде всего, между парами направленных к общей оси и навстречу друг другу азотистых оснований образуются Н-связи. При этом основания связываются в строго определённые, комплементарные пары: пиримидиновое основание только с пуриновым, а именно аденин с тимином (двумя Н-связями) и гуанин с цитозином (тремя Н-связями):

аденин тимин гуанин цитозин

R = сахарофосфат

В результате общее количество пуриновых остатков в молекуле ДНК должно точно равняться количеству пиримидиновых. Например, в сперме человека содержится 31% аденина, 19% гуанина, 31% тимина и 19% цитозина. ДНК туберкулёзных бацилл содержит большее количество гуанина и цитозина (по 36%), чем аденина и тимина (по 14%).

Второй вид сил, который стабилизирует каждую нить ДНК в виде моноспирали и двойную спираль в целом – так называемое стэкинг-взаимодействие. Оно означает, что азотистые основания, связанные между собой Н-связями, обращены к периферии своими гидрофобными фрагментами и ощущают отталкивающее действие молекул воды. Поэтому их пары плотнее располагаются параллельно друг другу, образуя стопки.

Молекулы ДНК имеют и третичную структуру - реальную компактную форму, которую они принимают в хромосоме живой клетки. Например, противоположные концы одной или сразу двух нитей ДНК способны слипаться (опять-таки за счёт водородных связей между азотистыми основаниями), образуя макрокольцо. Последнее может закручиваться на белках, называемых гистонами, в суперспирали, напоминающие жгуты. Суперспирали принимают самые различные формы, исследованием которых занимается топология. В ядре клетки содержатся двуспиральные нити ДНК, которые существуют в виде сложного комплекса с белками - нуклеопротеида хроматина. Плотную структурную упаковку хроматинов называют хромосомами. Белковые фрагменты заполняют желобки, имеющиеся на внешней поверхности двойной спирали ДНК, что способствует ещё более плотной их упаковке. Человеческой неоплодотворённой (гаплоидной) клетке присущ одинарный набор 46 хромосом, состоящих из 23 видов. При репликации двойная спираль расходится в нескольких местах, в которых с помощью специального фермента начинают синтезироваться короткие олигонуклеотиды - затравки будущей новой ДНК. На этих затравках другие ферменты ДНК-полимеразы инициируют сборку отдельных блоков ДНК. По мере удлинения блоков, двойная спираль раздвигается дальше. Затем образовавшиеся блоки сшиваются друг с другом ещё одним ферментом - ДНК-лигазой. Из-за антипараллельности ДНК, одна нить новой ДНК может расти непрерывно, в то время, как другая нить собирается из олигонуклеотидов. Так как на первых этапах биосинтеза ДНК весьма велика вероятность ошибок в выборе подходящих олигонуклеотидов, то начальные затравки вырезаются и могут пополнять нуклеотидом. Схематически процесс биосинтеза новых ДНК, называемый репликацией, показан на рис. 10.2. Этот процесс удалось наблюдать с помощью электронного микроскопа.

(Это рис.10.2)

Химизм репликации заключается в том, что ДНК-полимераза доставляет к месту сборки необходимый нуклеозид-5'-трифосфат (1, рис 10.3). Она же обеспечивает его присоединение к растущей цепи ДНК (2). Как видно, реакция сшивания представляет собой нуклеофильное замещение пирофосфатной группы P₂O₇^4- в нуклеозид-5’-трифосфате (1) в результате атаки его α -фосфатного фрагмента 3’-гидроксилом концевого нуклеотида ДНК (2). Таким образом, синтез цепи идёт в направлении 5’-3’. Очевидно, поскольку спирали ДНК антипараллельны, синтез новых молекул ДНК на двух матричных цепях протекает одновременно в противоположных направлениях.

Разумеется, новые молекулы ДНК наращиваются в строгом соответствии с принципом комплементарности азотистых оснований, т.е. в том месте, где на матричной нити ДНК находится, скажем, остаток 5’-дезоксиадениловой кислоты, на растущей молекуле ДНК присоединяется фрагмент 5’-дезокситимидиловой кислоты, и т.д. Именно этим обеспечивается образование из одной двуспиральной молекулы ДНК двух новых, полностью идентичных исходной. Каждая из них состоит из одной прежней нити ДНК и одной вновь синтезированной. Генетическая стабильность обеспечивается именно высокой степенью точности репликации, а также работой многих ферментов, которые могут исправлять возникающие при сборке ошибки, а также повреждения нити растущей ДНК

Рис. 10.3. Химическая реакция, лежащая в основе наращивания цепи при помощи ДНК-полимеразы (2) - Фрагмент растущей цепи ДНК; (1) – встраиваемый нуклеозид -5^’-трифосфат.