Оценка качества спермы перед осеменением .

для проверки качества спермы необходимо использовать подогретые предметные и покровные стекла, находящиеся во время работы на обогреваемом столике микроскопа. Для взятия пробы на исследование вращательными движениями сперму смешивают, приоткрывают пробку флакона и берут стерильной стеклянной палочкой или пастеровской пипеткой каплю спермы и помещают на предметное стекло. Флакон со спермой немедленно закрывают пробкой и помещают обратно в термос. Дают сперме нагреться до 38°С на обогревательном столике микроскопа. После чего при увеличении микроскопа в 100-180 раз отыскивают поле зрения с наибольшей подвижностью спермиев.

Подвижность спермиев оценивают по десятибалльной шкале. Высшую оценку (10 баллов) получает сперма, в которой практически все спермин имеют прямолинейно-поступательное движение. При оценке 9 баллов таких спермиев 90%, 8 баллов - 80, 7 баллов - 70% спермиев движутся прямолинейно-поступательно и т.д.

Замороженную сперму оценивают после оттаивания. При использовании спермы в соломинке один конец ее, закрытый специальной пробкой (стеклянный шарик и др.), отрезают стерильными ножницами и опускают во флакон с раствором 2, 9%-ного лимоннокислого натрия, подогретого до 38°С. Затем отрезают второй закрытый конец соломинки и оттаянную сперму выливают во флакон. Полученную смесь тщательно размешивают и с помощью соломинки берут каплю спермы для оценки на подвижность под микроскопом. Из каждой партии проверяют 1-2 соломинки.

При использовании спермы в облицованных гранулах, оболочка которых выполнена из оптически прозрачного полимерного материала, качество спермы оценивают перед осеменением животных без предварительной разгерметизации спермодозы. Для этого, предварительно протерев стерильной салфеткой, гранулу размещают на предметном стекле и прижимают ее вторым аналогичным стеклом с помощью специального зажима. Участок гранулы, расположенной между стеклами, подводят под объектив микроскопа и определяют процент спермиев с прямолинейно-поступательным движением.

В соответствии с ГОСТ 26030-83 (Изменение № 1) «Сперма быков замороженная» к использованию допускается сперма быков-производителей, имеющая следующие характеристики:

- подвижность спермиев, баллы (%), не ниже 4 (40);

- число спермиев с прямолинейно-поступательным движением (ППД) в дозе, млн., не менее 15;

- объем дозы, см3, О, I -1, 0;

- выживаемость спермиев при 38°С, ч, не менее 5;

- колититр отрицательный;

- микроорганизмы, вызывающие инфекционные заболевания, не допускаются.

От высокоценных быков-производителей и улучшателей, а также от быков, происходящих от родителей, признанных улучшателями, допускается к использованию сперма с подвижностью не ниже 3 баллов и числом спермиев с прямолинейно-поступательным движением в дозе не менее 10 млн.

20. Разбавление, хранение и транспортировка спермы

Чтобы увеличить объем эякулята, а также для того, чтобы сохранить оплодотворяющую спо­собность спермиев на более длительный срок, при хранении их вне организ­ма сперму разбавляют специальными средами.

Для сохранения спермы вне организма нужно создавать условия, кото­рые тормозили бы расходование внутренних запасов в спермиях и не вызы­вали их гибель.

Синтетическая среда обычно состоит из трех компонентов. В состав среды для спермы быка входят:

Сахара (глюкоза, лактоза) - служат источником энергии для спермиев. Помимо этого они участвуют в поддержании осмотического давления, пони­жают электропроводность среды, предохраняют спермии от потерь электри­ческого заряда. С желтком куриного яйца образуют биокомплексы, защи­щающие мембрану спермиев от повреждений при охлаждении.

Цитрат натрия. Создает буферность среды, нейтрализует конечные про­дукты жизнедеятельности спермиев, связывая ионы кальция и тяжелых ме­таллов, обеспечивает снижение их уровня до оптимального.

Глицерин. Защитное действие глицерина связано с понижением точки замерзания растворов. Глицерин задерживает начало кристаллизации (основ­ной причины гибели клеток при замораживании), замедляет рост кристаллов, снижает осмотическое давление растворенных веществ при замораживании до эвтектической точки (-46, 5⁰ С). Глицерин всегда находится в жидкой фазе раствора, вследствие чего концентрация осмотически активных веществ уменьшается, что и способствует сохранению клеток.

Желток куриных яиц. Содержит лецитин и липопротеины. Они создают на поверхности спермиев адсорбционный слой, предохраняющий спермии от холодового шока, который подстерегает спермии до температуры - 51⁰ С, то есть пока в сперме сохраняется жидкая фаза.

Спермосан ППК. Комплексный антибактериальный препарат, состоя­щий из пенициллина, полимиксина, канамицина. Такая комбинация эффек­тивно тормозит размножение микроорганизмов в сперме.

Для разбавления и кратковременного хранения спермы быка при темпе­ратуре +2-5⁰ С необходимы следующие компоненты: вода дистиллированная - 100 мл, глюкоза - 3 г, натрий лимоннокислый, трехзамещенный, пятивод-ный - 1, 4 г, желток куриного яйца - 12 мл, спермосан ППК - 75000 ИЕ.

С момента получения спермы от производителя до разбавления должно пройти не более 10 мин. В зависимости от подвижности и концентрации спермиев сперму быка разбавляют так, чтобы в одной дозе при всех способах хранения перед осеменением было 10-15 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением. Сперму быков, сохраненную при температуре +2-5⁰ С, используют для осеменения коров и телок в течение 3 суток с актив­ностью спермиев не ниже 7 баллов, а после хранения в замороженном со­стоянии - не ниже 4 баллов.

Температура синтетической среды перед разбавлением спермы должна быть одинаковой со спермой (27-35°С). Среду осторожно приливают к спер­ме, соблюдая правила асептики.

Для разбавления и замораживания спермы быка в форме гранул (капе­лек) применяют лактозо-желточную среду следующего состава: вода дистил­лированная - 100 мл, лактоза - 11, 5 г, желток куриного яйца - 20 мл, глице­рин - 5 мл.

Разбавляют сперму одномоментно, так чтобы в одной грануле (0, 2 мл) после оттаивания содержалось не менее 15 млн. подвижных спермиев. Раз­бавленную сперму (температура 31±1, 8°С) охлаждают при 2-5°С в течение 4 ч и замораживают на фторопластовых пластинках с лунками в специальных емкостях, заполненных жидким азотом. Наносят сперму на охлажденную пластину с помощью охлажденных шприцев или полиэтиленовой капельни­цы. После выдержки пластины в течение 1-2 мин над жидким азотом и затем в жидком азоте пластину поднимают до верхнего уровня емкости, охлажден­ной лопаткой сгребают гранулы в охлажденный контейнер или марлевый мешочек и переносят на хранение в специальное хранилище (КВ-620 и др.) емкостью 100-200 тыс. доз.

В 1975 г. Р. Кассу (Франция) для расфасовки спермы при замораживании впервые применил соломинки из полипропилена (пайеты) емкостью 0, 5 мл. На бейсогальской станции искусственного осеменения (Литва) в 1981 г. вве­дена была в эксплуатацию технологическая линия по замораживанию спермы быков в полипропиленовых соломинках отечественного производства емко­стью 0, 25 мл. Расфасовку проводят на специальной машине, которая автома­тически наполняет соломинки спермой и укупоривает стеклянными шарика­ми. Соломинки ставят в штативы по 30 штук и заключают в пластмассовые пеналы: их выдерживают 4 часа при температуре 4-5⁰ С, а затем переносят в газообразный азот (температура – 140⁰ С) на 3 мин. для замораживания.

Эта методика наиболее перспективна. Она позволяет достичь высокой степени асептизации, механизации и автоматизации на всех этапах техноло­гической обработки спермы, перевести замораживание спермы на промыш­ленную основу. Криоконсервация спермы в пайетах устраняет недостатки в технологии, присущие изготовлению как необлицованных, так и облицован­ных гранул, а также исключает потери спермы при оттаивании и осеменении самок.

Сперму, сохраняемую при 2-5°С, фасуют в одноразовые стерильные по­лиэтиленовые ампулы, полиэтиленовые пробирки объемом по 1 мл или во флаконы из-под антибиотиков. Полиэтиленовые ампулы запаивают, а про­бирки и флаконы закрывают стерильной нетоксичной пробкой и закрепляют ее резиновым кольцом. Сперму быка перевозят и хранят в широкогорлых пищевых или пластмассовых термосах.

Замороженную сперму перевозят и хранят в сосудах Дыюара марки СДС-50, СДС-20, СДС-5 и др. Эти сосуды представляют собой стальные или алюминиевые двустенные емкости с вакуумно-порошковой либо многослой­но вакуумной изоляцией.

Вместимость их варьирует от 5 до 50 л, суточный расход жидкого азота колеблется от 1 до 3% в зависимости от размеров сосу­дов и качества изоляции. Периодически сосуды пополняют жидким азотом. Азот доставляют на пункты искусственного осеменения в транспортных резервуарах на автомобилях - азотовозах.

Сохраняемая сперма должна быть полностью покрыта жидким азотом. Только в этом случае гарантируется сохранение оплодотворяющей способно­сти спермы в течение длительного времени. Установлено, что при подъеме канистр более чем на 10 см от уровня жидкого азота, температура сохраняе­мой спермы поднимается до -50-60⁰ С, а процессы рескристаллизации (обра­зование кристаллов при оттаивании), начинаются уже при температуре ми­нус 120-140°С, что ведет к снижению качества спермы. По этой же причине при перекладывании спермы из сосуда в сосуд нельзя держать емкости со спермой вне азота более 5-10 сек.

Оттаивание спермы

Оттаивать замороженную сперму нужно быстро, чтобы не образовались кристаллы, которые, как указывалось, губительно действуют на спермии. Для оттаивания спермы необходима водяная баня и специальный разбавитель. В качестве разбавителей в Приморском крае ис­пользуется 2, 9 % раствор лимоннокислого натрия, расфасованный в стеклян­ные ампулы объемом 1 мл, а также желточный разбавитель (В.И. Коровко, 1974). Последний представляет собой разбавитель, который применяется для хранения спермы при температуре 2-5⁰ С, но замороженный в форме гранул на фторопластовой пластине объемом 0, 4-0, 5 мл. Этот разбавитель можно долго хранить, и он лучше защищает сперму после оттаивания от неблаго­приятных факторов внешней среды. Желточный разбавитель нужно оттаи­вать также быстро, как и сперму (при температуре +38-40⁰ С), чтобы он не потерял своих защитных свойств.

Оттаивание спермы в цитратном разбавителе проводят так:

1. Тщательно моют и стерилизуют кипячением или фломбированием нужное количество пенициллиновых флаконов и пробок к ним.

2. Ампулу с цитратным разбавителем протирают спиртовым тампоном, открывают ее и содержимое выливают во флакон.

3. В водяной бане создают температуру не ниже 43-45°С и помещают в нее флакон с разбавителем (1 мл).

4. После того, как разбавитель нагреется до температуры 38-40°С, в него помещают гранулу спермы для оттаивания (температура измеряется по тер­мометру, помещенному в водяную баню).

5. Во время оттаивания спермы (15-20 сек) флакон нужно слегка пока­чивать, не вынимая из водяной бани. Это делается для того, чтобы флакон со спермой постоянно соприкасался с теплыми слоями воды, а также для рав­номерного размещения спермиев в разбавителе.

Как только гранула полностью растворится, набрать сперму в шприц и немедленно использовать.

Оттаивание спермы в желточном разбавителе.

1. В водяной бане, имеющей температуру 45-50°С, помещают сухой, стерильный, пенициллиновый флакон (больше 50⁰ С нельзя, иначе желток свернется).

2. После нагревания флакона до температуры 42-23°С, в него помещают 2-3 гранулы желточного разбавителя (чтобы объем среды был 0, 8-1, 0 мл).

3. После того, как температура желточного разбавителя достигнет тем­пературы 38-40⁰ С, в него помещают гранулу спермы для оттаивания.

4. Как только сперма оттает - немедленно использовать.

После оттаивания держать сперму в водяной бане или на столе, а также в шприце нельзя, это снижает ее качество. Сразу в водяной бане опаивать сперму для двух-трех коров или телок также нельзя, так как нарушается тем­пературный режим оттаивания спермы, что ухудшает ее качество.

Оттаянная сперма подвержена действию холодового удара, ее нельзя снова замораживать, так как она погибнет. Необходимо после оттаивания оберегать сперму от прямых солнечных лучей, яркого электрического света, резкого снижения или повышения температуры, воды, пыли, лекарственных и пахучих веществ, так как все это снижает оплодотворяющую способность спермы.