Тіршілікке қабілетті протопластарды алу.

Протопластарды нә тижелі бө ліп алу кө птеген факторларғ а байланысты: лпаның шығ у тегі (жапырақ, тұ қ ымжарнақ, тамыр, тозаң тү йірі, каллус ұ лпасы, суспензиядағ ы жасушалар), ө сімдіктің тү рі мен сорты, ө сімдіктің физиологиялық кү йі, ферменттердің қ ұ рамы, олардың сапасы, ортаның рН жә не осмостық заттың тү рі.

Протопластар суспензиясының сапасы тіршілікке икемді протопластардың санымен белгіленеді. Протопластардың саны Фукс-Розенталь камерасында есептеледі. Протопластың тығ ыздығ ы (суспензияның 1 мл-дегі саны) суспензияның маң ызды сипаттамасы. Егер ұ лпаның немесе ө сірілген жасушалардың ылғ алды массасының 1 граммынан 1х тен 5х дейін тіршілікке икемді протопластар шық са, онда протопластар жақ сы бө лініп алынды деп есептеледі.

Протопластардың бө лініп алынатын мө лшері жә не олардың ө міршең дігі ө сімдіктің тү ріне, жасына жә не физиологиялық кү йіне, яғ ни генетикалық жә не эпигенетикалық ерекшеліктеріне байланысты.

Протопластарды кө п мө лшерде тұ рақ ты алып отыру ү шін ө сімдіктерді белгілі бір жағ дайда ө сіру керек жә не олардың ең қ олайлы ө су кезең ін, нақ тылы бір мү шесін анық тап таң дап алу қ ажет.

In vitro ө скен жасушалар мен ұ лпалардан протопластарды бө ліп алудың мынадай ө з артық шылық тары бар: стерильдік, in vitro жағ дайында ө суге бейімділік. Бірақ жасуша қ абық шасының химиялық қ ұ рамының кү рделі болып ө згеруі жә не оның қ алың дауы ферменттік гидролизді қ иындатады. Бү тін протопластардың бө лініп алынуы ө сірген жасушалардың ішінде меристемалық жасушаларының сан жағ ынан ү лесіне сай болады, ал ол ү шін суспензиядағ ы жасушаларды жиі-жиі (2-3 тә улігінде) жаң а қ оректіа ортағ а кө шіріп отыру керек.

Суспензияда ө сірген жасушалардан протопластарды алу ү шін ең қ олайлы мезгіл, ол жасушалардың ө су кезең інің логарифмдік фазасының соң ында. Осы мезгілде жасуша қ абық шалары ферменттердің ә серімен оң ай ыдырап, ө міршең протопластарды береді. Протопластардың тіршілікке икемділігі оларды бө ліп алу жағ дайлары мен тә сілдеріне байланысты. Жасушаның плазмолиз кезінде сусыздандырылуы жә не қ абығ ының бұ зылуы оны шок кү йіне (кү йзеліске) душар етеді. Бұ жағ дайда цитоплазманың вакуольденуі артады, кө птеген липид тамшылары пайда болады, полисомалардың саны азаяды, ядро мен хлоропластар қ оюланады.

Фермент препаратының сапасы протопластардың бө ліп алынғ ан санына, мө лшеріне ғ ана емес, олардың кейбір қ асиеттеріне де ә сер етеді. Пектиндер мен целлюлозаларды гидролиздейтін саудалық фермент препараттарына қ оспа ретінде протеазалар, липазалар, нуклеазалар жә не басқ а ферменттер, фенолдық қ осылыстар, тұ здар кіреді. Олар плазмалемманың қ асиеттерін ө згертуі мү мкін. Осы токсикалық заттардан қ ұ тылу ү шін жә не протопластардың шығ уын арттыру ү шін ферменттерді тазалауғ а болады. Бірақ айта кететін мә селе, ө те жақ сы тазартылғ ан ферменттер протопластарды кө п мө лшерде алуғ а тиімсіз келеді. Кейде ферменттер ерітіндісіне қ орғ аушы заттар (протекторлар) қ осылады, мысалы, декстранның немесе калий сульфатының 0, 5% ерітінділері. Олар протеиндермен ә рекеттесіп, ферменттердің зиянды ә серін тө мендетеді.

Инкубациялық ортада иондардың, ә сіресе кальций мен магнийдің болуы, плазмалемманың тұ рақ тылығ ын арттырып, оқ шауланғ ан протопластардың сапасын жақ сартады. Оқ шауланғ ан протопластар механикалық жә не осмостық стреске ө те сезімтал болады. олар тек ішіне сің іп кіре алмайтын осмостық заттың гипертониялық ерітіндісінде ө здерінің осмостық тұ рақ тылығ ын сақ тай алады.

Ферменттік ерітіндісінен жуылып тазартылып алынғ ан тіршілікке икемді протопластар шок кү йінен шығ ып, біртіндеп ө зінің ішкі жү йесіндегі бұ зылғ ан қ ұ рылымдары репарацияланып, қ абығ ын қ айта қ ұ руғ а дайындалады.