Экспрессия генов в бактериальных клетках и микроорганизмах

Основной единицей наследственности любого организма являются гены. Они представляют собой участки молекулы ДНК, расположенной в хромосоме. В простейшем случае - один ген содержит информацию о структуре одного белка, в более сложном – о нескольких белках.

Гены определяют все характерные признаки и свойства живых организмов. При половом размножении образуется рекомбинантная ДНК, которая содержит генетическую информацию обоих родителей. Генная инженерия позволяет создать организмы с новыми наследственными признаками. Для достижения этого необходимо встроить (клонировать) природный или искусственно синтезированный ген в вирусы, бактериальную плазмиду или любые другие векторные системы, а затем перенести в геном хозяина-реципиента таким образом, чтобы встроенный ген сохранял способность экспрессировать белок.

Введение генов в бактерию и их экспрессия. Для введения генов в бактерии фрагменты геномной ДНК изменяют, удаляя из них некодирующие области и участки соседних генов, в следующей последовательности:

1. Для введения генов в клетки прокариот подбирают соответствующий вектор, способный проникнуть в клетку реципиента. Чаще всего используют ДНК–фаг или плазмиду бактерий.

2. Плазмиду разрезают рестриктазо й для образования «липких концов».

3. При необходимости производят надстройку концов ДНК у вектора, чтобы они были комплементарны концам ДНК вводимого гена.

4. ДНК донора разрушают рестриктазами для выделения генов.

5. Для введения генов в бактерии фрагменты геномной ДНК изменяют, удаляя из них некодирующие области и участки соседних генов.

6. При объединении в одном растворе ДНК вводимого гена и ДНК вектора, комплементарные концы «слипаются» и образуются водородные связи. С помощью ДНК-лигазы сшивают цепи гибридной ДНК.

7. Образованная гибридная молекула вводится в клетку бактерии-реципиента.

8. У прокариот структурный ген представляет собой непрерывный участок молекулы ДНК, а включение и выключение транскрипции обеспечивается дополнительными факторами транскрипции, которые связываются с соответствующими участками ДНК.

В бактериальной клетке содержится 2-3 тысячи различных белков, каждая из которых составляет в среднем 0, 04% от их общей массы (рис. 8.10).

Рис. 8.10. Бактериальная клетка

содержащая 2 – 3 тыс. белков

При клонировании и экспрессии в бактериях чужеродного гена доля кодируемого им индивидуального белка может достигать 40%. Клетки, в которых эта величина составляет 2% и более, называется суперпродуцентами. В целях создания оптимальных условий для наращивания культуры и синтеза в ней высоких концентраций белков, экспрессию клонируемых генов у бактерий продуцентов включают только на поздних стадиях их развития.

Экспрессия генов в дрожжах.

Дрожжевые клетки удобно использовать для получения разнообразных продуктов промышленного назначения. Преимуществами дрожжей, по сравнению с бактериями, является их рост на дешёвых субстратах и высокая генетическая стабильность при промышленном культивировании. Экспериментировать с дрожжевыми клетками легко, так как они имеют сравнительно малый размер генома и короткое время регенерации (несколько часов). В качестве объекта для клонирования и экспрессии рекомбинантных ДНК чаще всего используют Saccharomyces cerevisiae (рис. 8.11; 1 –экспрессирование; 2 - клонирование).

2 1

Рис. 8.11. Схема применения Saccharomyces cerevisiae