Практична робота

Дослід 1. Вивчення окисного фосфорилування в мітохондріях та дії роз’єднувача – 2, 4-динітрофенолу на цей процес.

Принцип методу. Визначення неорганічного фосфату ґрунтується на здатності амонію молібдату в кислому середовищі приєднувати залишок фосфорної кислоти з утворенням амонію фосфату. Амонію фосфат під дією відновника – аскорбінової кислоти утворює продукти, забарвлені в синій колір. В процесі окисного фосфорилування Ф_н вилучається з інкубаційного середовища, а тому інтенсивність синього забарвлення розчину зменшується.

Матеріальне забезпечення: щойно виділені мітохондрії з м’язів кроля; суміш № 1 – 0, 08 моль КН₂РО₄, 0, 255 моль KCl, 0, 05 моль MgCl₂ розчиняють в дистильованій воді, додають 0, 1 М розчин КОН до рН = 7, 4 та доводять об’єм в мірній колбі до 1 л; суміш № 2 – водний розчин глюкози з АТФ, що містить 90 мг глюкози та 30 мг АТФ в 1 мл; гексокіназа в 1 %-му розчині глюкози (0, 8 мг гексокінази в 1 мл); 5 %-й розчин сукцинату калію; 5 %-й розчин оцтової кислоти; 10 %-й розчин трихлороцтової кислоти (ТХО); 1 %-й розчин динітрофенолу; 2, 5 %-й розчин молібдата амонію в 10 М розчині H₂SO₄ (2, 5 г молібдата амонію розчиняють в 50 мл 20 М розчину H₂SO₄ і доводять об’єм водою до 100 мл); 5 %-й розчин аскорбінової кислоти.

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами за таблицею:

Ацетатна кислота додається для повноти денатурації білка в контрольній пробірці. Після інкубації в термостаті протягом 15 хв при 37^оС в кожну пробірку додають по 1 мл 10 %-го розчину ТХА; по 0, 5 мл 2, 5 %-го розчину молібдату амонію та по 0, 5 мл 5 %-го розчину аскорбінової кислоти. Впродовж 20 хвилин спостерігають за появою синього забарвлення.

Зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Визначення коефіцієнту окисного фосфорилування використовується з метою характеристики ефективності процесів енергопродукції в тканинах в нормі та при патології. Порушення синтезу АТФ спостерігають за умов дії на організм людини і тварин багатьох патогенних факторів хімічного (зокрема, природні та синтетичні токсини, лікарські засоби, тощо), біологічного (гормони, антибіотики, проміжні продукти метаболізму) та фізичного (іонізуюча радіація) походження. Всі вони спричинюють роз’єднання дихання та окисного фосфорилування за рахунок порушення здатності створювати та підтримувати електрохімічний протонний потенціал на внутрішній мембрані мітохондрій.

Дослід 2. Кількісне визначення активності каталази в крові.

Принцип методу. Каталаза – фермент класу оксидоредуктаз, що каталізує розщеплення гідрогену пероксиду на воду і оксиген:

каталаза

2 Н₂О₂ 2Н₂О + О₂

Метод базується на визначенні кількості гідрогену пероксиду, перетвореного ферментом за певний проміжок часу. Гідроген пероксиду розкладається каталазою, а його надлишок відтитровують за присутності сульфатної кислоти:

5H₂O₂ + 2 KMnO₄ + 3 H₂SO₄ → K₂SO₄ + 2 MnSO₄ + 8 Н₂О + 5О₂

Матеріальне забезпечення: розведена кров (1: 1000), дистильована вода, 1%-ний розчин Н₂О₂, 10 % розчин сульфатної кислоти, 0, 1 н розчин КМnO₄, колбочки, піпетки, бюретка.

Хід роботи. Розведену кров (1: 1000) наливають по 1 мл у дві колбочки, додають по 7 мл дистильованої воли, в дослідну пробу додають 2 мл 1 % Н₂О₂, а в контрольну – 5 мл 10 % розчину сульфатної кислоти. Дія каталази в кислому середовищі припиняється (у контрольній пробі), оскільки її рН оптимум – 7, 4. Колбочки залишають на 30 хв. при кімнатній температурі. Потім до дослідної проби додають 5 мл 10 % розчину Н₂SO₄, а до контрольної – 2 мл 1 % р-ну Н₂О₂. Вміст колбочок титрують 0, 1н р-ном КМnO₄ до появи стійкого рожевого забарвлення.

Каталазне число (Кч) розраховують за формулою:

Кч= (А-В) x 1, 7

А – кількість мл 0, 1 н р-ну КМnO₄, яка пішла на титрування контрольної проби;

В – кількість в мл 0, 1 н р-ну КМnO₄, яка пішла на титрування дослідної проби.

У нормі каталазне число становить 10-15 одиниць.

Каталазне число – це кількість гідрогену пероксиду (мг), що розкладається в 1 мкл досліджуваної крові.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Біологічна роль каталази полягає у захисті організму від шкідливого впливу гідрогену пероксиду, який утворюється при внутрішньоклітинному окисненні різних сполук.

За умов норми каталазне число становить в крові 10-15 одиниць. Однак визначення каталазного числа без одночасного визначення кількості еритроцитів є недоцільним, оскільки кількість фермента є залежною від кількості еритроцитів. Тому в клініці використовують не каталазні числа, а показник каталази, в якому чисельником є каталазне число, а знаменником – кількість еритроцитів в 1 мл крові. Цей показник становить у нормі 2-3´ 10^-6.

Висока активність каталази спостерігається при перніціозній анемії та інших макроцитарних анеміях, при введенні в організм кофеїну, ацетонових тіл, алкоголю. Пониження активності ферменту спостерігається при злоякісних пухлинах, інфекційних захворюваннях, таких як черевний тиф, скарлатина, малярія, туберкульоз легень.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. В організмі людини виявлено дефіцит заліза. Це спричинює зниження активності ферменту:

А. Глутатіонпероксидази

В. Карбоангідрази

С. Карбоксипептидази

D. Церулоплазміну

Е. Каталази

2. Спряження тканинного дихання з окисним фосфорилуванням відбувається за наявності електрохімічного градіенту іонів Н⁺ між матриксом та міжмембранним простором. Яка з перерахованих речовин може роз’єднувати процеси дихання та фосфорилування? А. Соматотропін

В. Ціаніди

С. Динітрофенол

D. Глюкоза

Е. Ротенон

3. За умов норми каталазне число становить:

А. 1-6 одиниць

В. 25-50 одиниць

С. 10-15 одиниць

D. 100-200 одиниць

Е. 250-1000 одиниць

4. Метод визначення якого із перерахованих ферментів базується на визначенні кількості гідрогену пероксиду, перетвореного ним за певний проміжок часу:

А. Аконітаза

B. Цитохромоксидаза

C. Лактатдегідрогеназа

D. Амілаза

E. Каталаза

5. Амітал – фармпрепарат, який застосовують у фармакології у якості снодійного засобу. Який механізм його дії на процеси тканинного дихання?

6. У хворого гіперфункція щитоподібної залози. Чому порушується біологічне окиснення в клітинах?

Приклади тестів “Крок-1”

1. При тиреотоксикозі підвищується продукція тиреоїдних гормонів Т₃ і Т₄, спостерігають схуднення, тахікардія, психічна збудливість та ін. Як саме впливають тиреоїдні гормони на енергетичний обмін у мітохондріях клітин?

A. Блокують дихальний ланцюг

B. Активують субстратне фосфорилування

C. Блокують субстратне фосфорилування

D. Роз’єднують процеси окиснення та окисного фосфорилування

Е. Активують окисне фосфорилування

2. Судово-медичний експерт під час розтину тіла 20-річної дівчини встановив, що смерть настала внаслідок отруєння ціанідами. Порушення якого процесу найбільш імовірно стало причиною смерті дівчини?

A. Тканинного дихання

B. Синтезу гемоглобіну

C. Транспорту кисню гемоглобіном

D. Синтезу сечовини

E. Транспорту водню за допомогою малатаспартатного механізму

3. Підвищену стійкість “моржів” до холодної води пояснюють тим, що в них синтезуються у великих кількостях гормони, які посилюють процеси окиснення і утворення тепла в мітохондріях шляхом роз'єднання біологічного окиснення та окисного фосфорилування. Які це гормони (гормон)?

A. Глюкагон

B. Адреналін і норадреналін

C. Йодвмісні гормони щитоподібної залози (йодтироніни)

D. Інсулін

E. Кортикостероїди

4. При патологічних процесах, які супроводжуються гіпоксією, відбувається неповне відновлення молекули кисню в дихальному ланцюзі і накопичення гідрогену пероксиду. Вкажіть фермент, який забезпечує його руйнування.

A. Каталаза

B. Цитохромоксидаза

C. Сукцинатдегідрогеназа

D. α -Кетоглутаратдегідрогеназа

E. Аконітаза

Індивідуальна самостійна робота студентів.

1. Роз’єднувачі окисного фосфорилування і регуляція термогенезу.

2. Універсальність хеміоосмотичної теорії для живих систем.

Література

Основна:

1. Біологічна хімія: Тести та ситуаційні задачі. / За ред. проф.О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – 360 с.

2. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

4. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

5. Клінічна біохімія / за ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006.- 432 с.

6. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – 298 с.

Додаткова:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина, 1998. – 701 с.

2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

3. Ленинджер А. Основы биохимии: В 3 т. – М.: Мир, 1985. – 1056 с.

4. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. – М.: Мир, 2004. – 381 с.

5. Николс Д.Дж. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотичскую теорию. – М.: Мир, 1985. – 190 с.

6. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. – М.: Наука, 1989. –564 с.

Тема № 9. Підсумковий контроль. Модуль 2.

Теоретичні питання

1. Предмет і завдання біохімії. Основні напрямки та розділи біохімії: статична, динамічна, функціональна біохімія, медична та клінічна біохімія.

2. Біохімія як фундаментальна медико-біологічна наука. Історія розвитку, наукові біохімічні школи, значення в системі вищої медичної освіти.

3. Внесок вчених кафедри біохімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького в розвиток біологічної хімії.

4. Хімічний склад живого організму. Біомолекули (білки, вуглеводи, ліпіди, нуклеїнові кислоти, гормони, вітаміни тощо), їх біохімічні функції. Характерні риси живої матерії: обмін речовин й енергії та їх зв’язок із зовнішнім середовищем.

5. Структурні елементи прокаріотичних та еукаріотичних клітин. Основні функції субклітинних органел, їх фракційне розділення методом ультрацентрифугування.

6. Принципи основних методів біохімічних досліджень:

• осадження речовин з розчину, висолювання білків;
• оптичні методи в біохімії (фотоелектроколориметрія, спектрометрія, спектрофотометрія, флюоресцентний аналіз);
• електрофорез (горизонтальний, диск-електрофорез, ізоелектричне фокусування, імуноелектрофорез);
• хроматографія (афінна, іонообмінна, тонкошарова, газова, гель-хроматографія);
• полярографія;
• манометричний та радіоізотопний методи;
• імуноферментні методи;
• полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

7. Мета проведення біохімічних лабораторних досліджень і критерії оцінки використаних методів лабораторних досліджень.

8. Матеріал для лабораторних діагностичних досліджень, принципи забору та збереження матеріалу для лабораторних досліджень.

9. Характеристика помилок, що мають місце під час проведення лабораторних досліджень.

10. Ферменти: визначення; властивості ферментів як біологічних каталізаторів реакцій обміну речовин.

11. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів: електрохімічні (поверхневий заряд молекули) властивості, розчинність, термодинамічна стабільність білкових молекул-ферментів, осадження, денатурація, взаємодія з лігандами та її функціональне значення

12. Прості та складні білки-ферменти. Кофактори, коферменти та простетичні групи складних ферментів. Навести приклади. Роль іонів металів у функціонуванні ферментів.

13. Будова ферментів: активний, регуляторний (алостеричний) центри, їх значення.

14. Рівні структурної організації ферментів. Мультиферментні комплекси, ферментативні ансамблі, поліфункціональні ферменти, їх переваги.

15. Номенклатура та класифікація ферментів. Типи реакцій, що каталізують окремі класи ферментів. Шифр ферментів.

16. Властивості ферментів:

• залежність активності ферментів від рН середовища (пояснити і зобразити графічно);
• залежність активності ферментів від температури (пояcнити і зобразити графічно).

17. Специфічність ферментів. Види специфічності (абсолютна, відносна, стереоспецифічність). Навести приклади.

18. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів. Навести приклади.

19. Тканинна (органна) специфічність ферментів. Навести приклади.

20. Класифікація коферментів за хімічною природою та за типом реакції, яку вони каталізують. Навести приклади.

21. Коферменти – переносники атомів водню та електронів (НАД⁺, НАДФ⁺ - коферменти – похідні вітаміну РР; ФАД, ФМН – коферменти – похідні вітаміну В₂ – рибофлавіну; роль вітаміну С в окисно-відновних реакціях).

22. Коферменти – переносники хімічних груп (піридоксалеві коферменти; НS-КоА – коензим ацилювання; ліпоєва кислота; фолієва кислота).

23. Коферменти ізомеризації, синтезу та розщеплення С–С зв’язків (тіаміндифосфат; карбоксибіотин – біологічно активна форма вітаміну Н – біотину; метилкобаламін та дезоксиаденозилкобаламін – похідні вітаміну В₁₂).

24. Ізоферменти, визначення, особливості будови та функціонування.Значення в діагностиці захворювань ізоферментів лактатдегідрогенази і креатинфосфокінази.

25. Основні положення кінетики ферментативних реакцій: залежність швидкості реакції від концентрації субстрату, ферменту, рН та температури. Представити графічну залежність. Смислове значення величини К_m (спорідненість ферменту до субстрату).

26. Графічний і математичний вираз залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату за Міхаелісом-Ментен і Лайнуівером-Берком.

27. Принципи кількісного визначення активності ферментів: за кількістю продукту, що утворюється під дією ферменту; за кількістю субстрату, що використовується; за зміною кількості коферменту (окисно-відновні перетворення для НАД та ФАД). Одиниці ферментативної активності.

28. Механізми дії ферментів (перетворення субстрату) утворення фермент-субстратного комплексу та процес перетворення субстрату. Ефекти зближення та орієнтації; кислотно-основного каталізу; нуклеофільного та електрофільного каталізу.

29. Механізми каталітичної дії хімотрипсину та ацетилхолінестерази.

30. Регуляція ферментативних процесів шляхом зміни кількості ферментів (конститутивні та адаптивні ферменти).

31. Ензимодіагностика (визначення). Зміни активності ферментів плазми та сироватки крові як діагностичні (маркерні) показники розвитку патологічних процесів (інфаркту міокарда, захворювання печінки, підшлункової залози, м’язової тканини).

32. Ензимопатологія (визначення). Вроджені (спадкові) та набуті вади метаболізму, (приклади, їх клініко-лабораторна діагностика).

33. Ензимотерапія (визначення). Використання ферментів, кофакторів та інгібіторів ферментів (ацетилсаліцилова кислота, алопуринол, контрикал, сульфаніламідні препарати та інші) в якості лікарських засобів.

34. Механізм дії ферментів-фармацевтичних препаратів при захворюваннях травної системи, при гнійно-некротичних процесах, як фібринолітичних препаратів та інше.

35. Активатори та інгібітори ферментів: приклади та механізми дії.

36. Типи інгібірування ферментів: зворотне (конкурентне, неконкурентне) та незворотнє інгібування.

37. Регуляція ферментативних процесів. Шляхи та механізми регуляції: алостеричні ферменти; ковалентна модифікація ферментів, обмежений протеоліз. Дія регуляторних білків.

38. Циклічні нуклеотиди (цАМФ, цГМФ) як регулятори ферментативних реакцій та біологічних функцій клітини.

39. Принципи та методи виявлення ферментів у біооб'єктах. Одиниці виміру активності та кількості ферментів.

40. Поняття про обмін речовин та енергії. Характеристика катаболічних, анаболічних та амфіболічних шляхів метаболізму, їх значення.

41. Екзергонічні та ендергонічні біохімічні реакції; роль АТФ та інших макроергічних фосфатів у їх спряженні.

42. Внутрішньоклітинна локалізація метаболічних шляхів, компартменталізація метаболічних процесів в клітині. Виділення субклітинних структур методом диференційного центрифугування.

43. Етапи катаболізму біомолекул: білків, вуглеводів, ліпідів; їх характеристика.

44. Найважливіші метаболіти шляхів обміну білків, вуглеводів, ліпідів; їх роль в інтеграції метаболізму клітини.

45. Цикл трикарбонових кислот (ЦТК): внутрішньоклітинна локалізація ферментів ЦТК; послідовність реакцій ЦТК; характеристика ферментів та коферментів ЦТК; реакції субстратного фосфорилування в ЦТК; значення в обміні печовин

46. Цикл трикарбонових кислот (ЦТК): механізми регуляції, вплив алостеричних модуляторів. Анаплеротичні реакції ЦТК. Енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот.

47. Піридинзалежні дегідрогенази. Будова НАД⁺ і НАДФ⁺. Їх значення у реакціях окиснення та відновлення.

48. Флавінзалежні дегідрогенази. Будова ФАД і ФМН. Їх роль у реакціях окиснення та відновлення.

49. Убіхінон, будова та його роль у реакціях окиснення та відновлення.

50. Цитохроми та їх роль у тканинному диханні. Будова їх простетичної групи.

51. Молекулярна організація ланцюга транспорту електронів (дихального ланцюга) мітохондрій: послідовність переносників електронів в дихальному ланцюгу; роль редокс-потенціалів у транспорті електронів і протонів.

52. Надмолекулярні комплекси дихального ланцюга внутрішніх мембран мітохондрій.

53. Шляхи включення відновлювальних еквівалентів (електронів та протонів) у дихальний ланцюг мітохондрій (повний і вкорочений дихальні ланцюги).

54. Шляхи утворення АТФ в клітинах – субстратне та окисне фосфорилування.

55. Хеміосмотична теорія окисного фосфорилування – молекулярний механізм генерації АТФ в процесі біологічного окиснення.

56. Електрохімічний градієнт протонів (Dm_Н⁺), що утворюється під час функціонування електронно-транспортного ланцюга його роль у спряженні транспорту електронів в мітохондріях з синтезом АТФ. Пункти спряження транспорту електронів та фосфорилування, коефіцієнт окисного фосфоритування АТФ.

57. Схема хеміосмотичного механізму спряження транспорту електронів у дихальному ланцюгу з синтезом АТФ. Молекулярна будова та принцип дії АТФ-синтетази. Коефіцієнт окисного фосфорилювання. Регуляція тканинного дихання (дихальний контроль).

58. Інгібітори транспорту електронів в дихальному ланцюгу мітохондрій. Пояснити механізм дії. Навести приклади.

59. Роз’єднувачі транспорту електронів та окисного фосфорилування в дихальному ланцюгу мітохондрій. Пояснити механізм дії. Навести приклади.

60. Активні форми кисню, механізми їх утворення та інактивації.

61. Пояснити основні принципи визначення активності ферментів на прикладі амілази слини (йод-крохмальна реакція та реакції Тромера).

62. Довести білкову природу ферментів біуретовою реакцією, реакцією Фоля. Пояснити принципи методів.

63. Пояснити термолабільність ферментів на прикладі визначення активності амілази слини, яка попередньо нагріта або охолоджена та попередньо не оброблена.

64. Намалювати та пояснити графіки залежності активності пепсину та амілази слини від рН середовища із зазначенням рН оптимуму цих ферментів.

65. Довести абсолютну специфічність сахарази (в реакціях з сахарозою та крохмалем). Які ще види специфічності ферментів існують?

66. Пояснити вплив модуляторів на активність ферментів на прикладі визначення активності холінестерази в присутності хлориду кальцію та фосфаколу, на прикладі активності амілази слини в присутності натрію хлориду і купруму сульфату.

67. Як можна довести функціонування ЦТК? Принцип визначення активності ферментів ЦТК. Довести функціонування ЦТК за використанням ацетилКоА, за утворенням СО₂, за вивільненням з проміжних продуктів атомів водню.

68. Інгібування ферментів ЦТК малоновою кислотою. Назвіть тип інгібування. Яким чином можна позбавитись негативного впливу малонової кислоти? Намалюйти графік залежності активності ферментів ЦТК від концентрації субстрату без малонової кислоти та в її присутності. До якого класу та підкласу ферментів належать ферменти ЦТК?

69. Вивчення активності сукцинатдегідрогенази мітохондрій. До якого класу та підкласу ферментів належить цей фермент? Пояснити принцип методу. Назвати інгібітори ферментів дихального ланцюжка, інгібітори окисного фосфорилування.

70. Дослідити процес окисного фосфорилування в мітохондріях, пояснити, на чому він базується. Які фармакологічні та фізіологічні сполуки є роз’єднувачами дихання і фосфорилування? Пояснити біохімічний механізм їх дії.