Осадження концентрованими кислотами.

Принцип методу. При дії на білок концентрованих мінеральних і органічних кислот відбувається денатурація білка внаслідок дегідратації та утворення комплексних сполук. В більшості мінеральних кислот осад денатурованого білка може розчинитися при надлишку кислоти, хоча білок не повертається до нативного стану. Тільки в присутності азотної, сульфосаліцилової та трихлороцтової кислот утворюється стійкий осад і це застосовується в медичній практиці для визначення вмісту білка в біологічних рідинах.

Хід роботи. В чотири пробірки наливають по 1 мл кислот: в першу - концентрованої азотної кислоти; в другу - концентрованої сірчаної кислоти; в третю - 10% розчину трихлороцтової кислоти, в четверту - 2% розчину сульфосаліцилової кислоти. Обережно по стінці в кожну пробірку наливають рівний об’єм розчину білка. При додаванні надлишку азотної, трихлороцтової і сульфосаліцилової кислот осад не розчиняється, а при додаванні надлишку сірчаної кислоти осад розчиняється.

1.2. Денатурація білків під впливом високої температури.

Принцип методу. Більшість білків випадають в осад і денатурують при температурі вище 50 - 55^оС внаслідок руйнування водневих і гідрофобних зв’язків. Але деякі білки, в складі яких багато дисульфідних зв’язків, стійких при високій температурі, здатні до ренатурації, не втрачають своєї структури і функціональної активності після припинення дії високої температури (ферменти трипсин, рибонуклеаза).

Хід роботи. В пробірку вміщують 1 мл розчину білка, нагрівають і спостерігають за утворенням осаду.

1.3. Розділення альбумінів і глобулінів методом висолювання.

Принцип методу. Зворотне осадження грунтується на дегідратації молекул білка з одночасною нейтралізацією їх зарядів. При додаванні великої кількості води білок повертається до попереднього стану без втрати своїх властивостей. Зворотне осадження білків відбувається під впливом концентрованих розчинів сульфату амонію, солей лужно-земельних металів (висолювання) або спиртом, ацетоном при низьких температурах. В залежності від величини заряду та молекулярної маси, білки осаджуються (висолюються) розчинами солей різної концентрації, що можна використати для розподілу білків.

Хід роботи. В пробірку наливають 2-3 мл сироватки крові, додають рівний об’єм насиченого розчину сульфат амонію і перемішують. В осад випадають глобуліни (50% насичення розчину), які мають відносно велику молекулярну масу і невеликий заряд. Осад відфільтровують. До фільтрату, в якому залишились альбуміни, додають кристалічний сульфат амонію до тих пір, поки сіль перестане розчинятися і тоді випадають в осад альбуміни (100% насичення), які мають відносно невелику молекулярну масу і великий заряд. Осад альбумінів відфільтровують. Фільтрат перевіряють на відсутність білків за допомогою біуретової реакції. Осади альбумінів і глобулінів на фільтрі розчиняють в 3 - 5 мл води, щоб впевнитися, що висолювання носить зворотний характер.

Практичне значення роботи. Осадження білків методом висолювання використовують у фармацевтичній практиці для одержання очищених білкових препаратів, у тім числі ферментів і гормонів. Таке висолювання білків сироватки крові дозволяє розділити їх на альбуміни і глобуліни для визначення альбуміно-глобулінового коефіцієнту, який може змінюватись при різних патологічних станах.