Хід заняття

1. Контроль вихідного рівня знань студентів з даної теми (на основі перелічених питань змісту теми)

2. Практична частина

2.1. Характеристика етапів роботи

2.1.1 Дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) - матеріальний субстрат спадковості та мінливості.

ДНК - це макромолекули, полімери, що утворені нуклеотидами. До складу одного нуклеотида входить пентоза (дезоксирибоза), ортофосфорна кислота і азотиста основа (пуринова чи піримідинова). Види азотистих основ, що включають нуклеотиди ДНК: аденін (А), гуанін (Г), цитозин (Ц), тимін (Т). Сполучення нуклеотидів у макромолекулу ДНК відбувається шляхом взаємодії ортофосфорної кислоти між ОН^- групою в положенні 5¢ дезоксирибози одного нуклеотиду з гідроксилом в положенні 3¢ пентози наступного з утворенням фосфодіефірного зв’язку. Збирання полінуклеотидного ланцюга здіснюється за участю фермента полімерази.

Особливістю структурної організації ДНК є те, що її молекули утворені двома полінуклеотидними ланцюгами. Відповідно до трьохвимірної моделі ДНК, запропонованої в 1953 р. американським біофізиком Дж.Уотсоном і англійським біофізиком і генетиком Ф.Кріком, ці ланцюги з’єднуються один з одним водневими зв’язками між азотистими основами за принципом комплементарності: А з’єднується з Т двома водневими зв’язками, а між Г і Ц різних ланцюгів утворюються три водневі зв’язки. Таке сполучення азотистих основ забезпечує зв’язок двох ланцюгів і збереження однакової відстані між ними по усій довжині.

Важлива особливість об’єднання двох полінуклеотидних ланцюгів у молекулу ДНК - антипаралельність: 5¢ -кінець одного ланцюга сполучається з 3¢ -кінцем іншого і навпаки.

Дані рентгеноструктурного аналізу засвідчили, що дволанцюгова молекула ДНК утворює правозакручену спіраль, закручену навколо власної осі; діаметр спіралі - 2нм, довжина кроку - 3, 4нм, до кожного закруту входить 10 пар нуклеотидів.

У живій клітині подвійна спіраль, що становить вторинну структуру ДНК, не має вигляду розгорнутої молекули, а додатково згорнута в просторі, утворюючи третинні структури - суперспіралі. У суперспіралізованому стані молекула ДНК у комплексі з певними клітинними білками входить до складу нуклеоїду прокаріотів та ядерного хроматину евкаріотів. Завдяки суперспіралізації довгі молекули ДНК формують компактні утворення, зокрема хромосоми ядра.

Таким чином, в структурній організації молекули ДНК розрізняють первинну будову - полінуклеотидний ланцюг, вторинну - два комплементарні один до одного та антипаралельні полінуклеотидні ланцюги, з’єднані водневими зв’язками, і третинну - трьохвимірну спіраль з певними просторовими характеристиками.

Основні біологічні функції ДНК:

1. Збереження спадкової інформації. Кількість ДНК у соматичних і статевих клітинах організму людини є сталою величиною, яку ці клітини отримують у процесі запліднення батьківських гамет і подальшого поділу зиготи.

2. Передавання спадкової інформації нащадкам шляхом подвоєння молекул ДНК під час реплікації. Механізм реплікації напівконсервативний: в розплітанні подвійної спіралі ДНК бере участь фермент геліказа, утворені при цьому ділянки зв’язуються спеціальними дестабілізуючими білками. В місцях розходження полінуклеотидних ланцюгів (в зонах реплікації) утворюються реплікаційні вилки. В кожній з цих ділянок за участю фермента ДНК-полімерази синтезується ДНК двох нових дочірніх молекул. В процесі синтезу реплікаційна вилка рухається вздовж материнської спіралі і захоплює нові зони.

Особливість ДНК-полімерази - її нездатність почати синтез нового полінуклеотидного ланцюга шляхом звичайного зв’язування двох нуклеозидтрифосфатів: необхідний 3¢ -ОН-кінець полінуклеотидного ланцюга, що спарений з матричним ланцюгом ДНК, до якого ДНК-полімераза може лише додавати нові нуклеотиди. Такий полінуклеотидний ланцюг називається праймером (‘’затравка’’). Функцію праймера для синтезу полінуклеотидних ланцюгів ДНК в процесі реплікації виконують короткі послідовності РНК, що утворюються за участю фермента РНК-праймази. Вказана особливість ДНК-полімерази є свідченням того, що матрицею при реплікації може бути лише той ланцюг ДНК, котрий несе спарений з ним праймер, що має вільний 3¢ -ОН-кінець. Механізм реплікації відзначається надзвичайно високою точністю відтворення структури ДНК, і в її підтриманні важлива роль належить, перш за все, ДНК-полімеразі.

3. Реалізація генетичної інформації. Ця біологічна функція здійснюється за рахунок передачі закодованої в ДНК інформації молекулам інформаційних (матричних) РНК (транскрипції) та подальшої розшифровки цієї інформації при синтезі білків (трансляції). Сукупність зазначених біологічних функцій ДНК та механізмів їх реалізації отримав назву - центральна догма молекулярної біології.

а) Розглянути таблицю і зарисувати схему процесу реплікації ДНК

2.1.2 Рибонуклеїнові кислоти (РНК) - посередники в перекодуванні і реалізації біологічної інформації.

РНК представлені одним полінуклеотидним ланцюгом, який складається з чотирьох різновидів нуклеотидів, що містять пентозу (рибозу), ортофосфорну кислоту і одну азотистих основ (А, Г, Ц, У (урацил)). РНК синтезується на молекулі ДНК за допомогою ферментів РНК-полімераз з дотриманням принципу комплементарності та антипаралельності, зокрема, аденіну ДНК комплементарний урацил РНК.

Матричні (інформаційні) РНК (мРНК, або іРНК) Це клас РНК, що складають 2-5% загальної кількості клітинної РНК. мРНК виконують функцію переносників генетичної інформації від геному (ядерної ДНК) до білоксинтезуючої системи клітини. Вони є інформаційними матрицями, які визначають амінокислотні послідовності в молекулах поліпептидів, що синтезуються в рибосомах.

мРНК синтезується на відповідних ділянках ДНК. Процес синтезу мРНК - транскрипція - починається з виявлення РНК-полімеразою особливої ділянки в молекулі ДНК - промотора. Після приєднання до промотора РНК-полімераза розплітає закрут спіралі ДНК, що розташований поруч. Два ланцюги ДНК у цьому місці розкручуються, і на одному з них фермент здійснює синтез мРНК. Збирання рибонуклеотидів у ланцюг відбувається з дотриманням їх комплементарності нуклеотидам ДНК, а також антипаралельно відносно матричного ланцюга ДНК. РНК-полімераза здатна збирати полінуклеотид лише від 5¢ -кінця, і тому матрицею для транскрипції може бути лише один з двох ланцюгів ДНК, а саме той, котрий обернений до фермента своїм 3¢ -кінцем. Такий ланцюг називається кодогенним. Просуваючись вздовж кодогенного ланцюга ДНК, РНК-полімераза здійснює поступове точне переписування інформації до того часу, поки не зустріне специфічної нуклеотидної послідовності - термінатора транскрипції. В цій ділянці РНК-полімераза від’єднується і від матриці ДНК, і від синтезованої мРНК. Таким чином, мРНК містить точну копію інформації, записаної у відповідній ділянці ДНК. Фрагмент молекули ДНК, що включає промотор, структурні гени (цистрони) і термінатор, утворює одиницю транскрипції - транскриптон.

Триплети нуклеотидів мРНК, що розташовані поряд - це кодони. Послідовність кодонів мРНК кодує послідовність амінокислот в поліпептидному ланцюгу.

Транспортні РНК (тРНК) На тРНК припадає 10-20% клітинної РНК. Їх молекули - це полірибонуклеотидні ланцюги, довжина яких - 70-90 нуклеотидів. тРНК постачає необхідні амінокислоти до місця збирання поліпептидних ланцюгів і, таким чином, виконує функцію трансляційного посередника. Первинна структура тРНК, що визначається послідовністю нуклеотидів, формує вторинну структуру тРНК, що має форму листка конюшини. Остання зумовлює трьохвимірну третинну структуру, для якої характерне утворення двох перпендикулярно розташованих подвійних ланцюгів. Один з них утворений акцепторною зоною, другий - антикодоновою. До акцепторної зони приєднується амінокислота, а на антикодоновій розміщений антикодон (триплет нуклеотидів, що комплементарнийкодону мРНК). Ці ділянки максимально віддалені одна від одної. Стабільність третинної структури тРНК підтримується завдяки виникненню додаткових водневих зв’язків між основами полінуклеотидного ланцюга, що локалізуються в різних її ділянках, але просторово наближені в третинній структурі.

Одна з особливостей тРНК - наявність нетипових основ, що виникають внаслідок хімічної модифікації вже після включення нормальної основи в полінуклеотидний ланцюг. Ці змінені основи зумовлюють структурну різноманітність тРНК при спільному плані їх будови. На особливу увагу заслуговують модифікації основ, що формують антикодон, які впливають на специфічність його взаємодії з кодоном. Наприклад, нетипова основа інозин, що інколи стоїть в першому положенні антикодону тРНК, здатна помилково сполучатись з трьома різними третіми основами мРНК - У, Ц, А. Оскільки одна з властивостей генетичного коду є його виродженість, більшість амінокислот шифрується кількома кодонами, які відрізняються переважно третьою основою. Завдяки неспецифічному зв’язуванню модифікованої основи антикодоном одна тРНК впізнає кілька кодонів-синонімів. Встановлено також існування кількох видів тРНК, що здатні сполучатись з одним і тим самим кодоном. В результаті в цитоплазмі зустрічається близько 40 різних молекул тРНК, і цієї кількості достатньо, щоб транспортувати 20 різних амінокислот до місця синтезу білка.

Поряд з функцією точного впізнавання визначеного кодону в мРНК молекула тРНК постачає до місця синтезу поліпептидного ланцюга строго визначену амінокислоту, зашифровану за допомогою даного кодону.

Рибосомні РНК (рРНК) Це клас клітинних РНК, що входять до складу рибосом прокаріотичних і еукаріотичних клітин. На рРНК припадає до 90% загальної кількості клітинних РНК.

рРНК разом із специфічними білками становлять основу структури та функції рибосом, в яких відбувається процес трансляції - біосинтез поліпептидних ланцюгів на основі коду, що доставляється мРНК.

В рибосомі є дві борозенки: одна утримує поліпептидний ланцюг, який нарощується в процесі трансляції, а інша - мРНК. Окрім цього, в рибосомі розрізняють дві ділянки, які зв’язують тРНК. В аміноацильній розташована аміноацил-тРНК, в пептидильній - тРНК, що навантажена ланцюжком амінокислот. В кожний момент рибосома екранує сегмент мРНК завдовжки близько 30 нуклеотидів.

В ході трансляції виділяють три фази:

1. фаза ініціації (початок синтезу поліпептиду) – починається з утворення ініціюючого комплексу до якого входять 30S–субодиниця, мРНК, формілметіоніл – тРНК та три специфічні фактои ініціації білкової природи. На наступному етапі цей комплекс взаємодіє з 50S-субодиницею з утворенням активної 70S-рибосоми. В утвореному 70S-рибосомальному функціональному комплексі існують дві ділянки зв’язування тРНК (аміноацильна та пептидна);

2. фаза елонгації (продовження пептиду) включає всі реакції від моменту утворення першого пептидного зв’язку до приєднання останньої амінокислоти;

3) фаза термінації (завершення синтезу поліпептиду) пов’язана з впізнаванням специфічним рибосомним білком одного з термінуючих кодонів (УАА, УАГ, УГА). При цьому до останньої амінокислоти в поліпептидному ланцюгу приєднується Н₂О і її карбоксильний кінець від’єднується від тРНК. В результаті завершений поліпептидний ланцюг втрачає зв’язок з рибосомою і вона розпадається на дві субчастки.

а) Заповнити таблицю:

Порівняльна характеристика нуклеїнових кислот

2.1.2 Вивчити властивості генетичного коду.

Генетичний код - це сукупність знаків, символів та система правил, згідно з якими структурна інформація, що міститься в нуклеїнових кислотах, може бути трансформованою в специфічну первинну структуру поліпептидів, яка, в свою чергу, визначає всі біологічні властивості білкових молекул.

Властивості генетичного коду:

1. Код є універсальним для всіх біологічних систем - вірусів, бактерій, вищих організмів.

2. Код є однонаправленим, тобто інформативним лише в тому випадку, коли зчитується ‘’ зліва направо ‘’.

3. Код є безперервним, тобто має лінійний безперервний порядок зчитування - між кодонами немає ‘’розділових знаків’’.

4. Код є таким, що не перекривається - після зчитування інформації з одного триплета рамка зчитування переміщується вправо відразу на три нуклеотиди.

5. Код є виродженим, тобто кожна амінокислота кодується не одним, а декількома кодонами.

6. Код є однозначним – певний триплед кодує лише одну амінокислоту.

Таблиця 1. Генетичний код іРНК

а) Вирішити задачі:

Задача 1. Скільки молекул рибози і ортофосфорної кислоти міститься в молекулі іРНК, якщо кількість цитозину 1000, урацилу 500, гуаніну 600, аденіну 400?

Задача 2. Скільки міститься а) аденілових; б) тимідилових; в) гуанілових нуклеотидів у фрагменті ДНК, якщо в ньому знайдено 950 цитидилових нуклеотидів, що складає 20 % від загальної кількості нуклеотидів у цьому фрагменті ДНК?

Задача 3. Частина правого ланцюга ДНК має такий нуклеотидний склад: ГГГ-ЦАТ-ААЦ-ГЦГ... Визначте: а) порядок чергування нуклеотидів у лівому ланцюгу; б) вміст кожного нуклеотиду у фрагменті ДНК; в) довжину цієї ділянки ДНК.

Задача 4. У фрагменті ДНК знайдено 1120 аденілових нуклеотидів, що складає 28 % загальної кількості нуклеотидів. Скільки в даному фрагменті міститься гуанілових, цитидилових, тимідилових нуклеотидів? Яка довжина гена?

Задача 5. Визначити послідовність амінокислот у поліпептиді, закодованому геном за таким складом нуклеотидів: ТТТ-ТАЦ-АЦА-ТГГ-ЦАГ.

Задача 6. Хімічний аналіз показав, що 26% загальної кількості нуклеотидів іРНК припадає на аденін, 6 - на урацил, 40 - на цитозин. Яким повинен бути нуклеотидний склад відповідної дволанцюгової ДНК?

Задача 7. Білок рибонуклеаза містить 224 амінокислоти. Визначити молекулярну масу гена, довжину гена і молекулярну масу білка рибонуклеази.

Задача 8. Яка молекулярна маса гена, якщо в одному його ланцюгу запрограмовано білок із молекулярною масою 3000?

Задача 9. Довжина гена 1200нм. Визначити молекулярну масу білка і гена, в якому закодований цей білок.

Задача 10. У систему для штучного синтезу білка ввели тРНК, які мають антикодони: ЦАГ, УУА, АЦА, ЦЦА. Визначте, які амінокислоти зможуть брати участь у біосинтезі білка.

Задача 11. Фрагмент адренокортикотропного гормону людини, який виробляється передньою часткою гіпофізу, має структуру: сер-тир-сер-мет. Визначте антикодони тРНК, які беруть участь у біосинтезі фрагмента адренокортикотропного гормону.

Задача 12. Вірусом тютюнової мозаїки синтезується ділянка білка: ала-тре-сер-глу-мет. Під дією азотної кислоти (мутагенний фактор) цитозин внаслідок дезамінування перетворюється на урацил. Який білок утвориться, якщо цитидилові нуклеотиди зазнали такого хімічного перетворення?

Задача 13. Четвертий пептид у нормальному гемоглобіні (гемоглобін А) складається з таких амінокислот: вал-гіс-лей-тре-про-глн-глн-ліз. У хворого на серпоподібно-клітинну анемію склад амінокислот четвертого пептиду такий: вал-гіс-лей-тре-про-ліз-глн-ліз. Які зміни в ДНК призвели до захворювання?

Задача 14. У здорової людини з сечею виділяються наступні амінокислоти: аланін, серин, глутамінова кислота, гліцин. У людини, що хвора на цистинурію, виділяються амінокислоти, яким відповідають триплети іРНК: УЦУ, УГУ, ГЦУ, ГГУ, ЦАГ, ЦГУ, ААА. Виділення яких амінокислот характерне для хворих на цистинурію?

Задача 15. Визначте антикодони тРНК, які беруть участь у синтезі білка, що кодується фрагментом ДНК: ГГТ-АЦГ-АТГ-ТЦА-АГА.

2.2. Оформлення результатів практичної роботи

Схему реплікації ДНК студенти зарисовують в альбом, заповнену таблицю і вирішені задачі записують в альбом.

3. Вироблення практичних навиків

Вміти застосовувати знання генетичного коду для пояснення виникнення патологічних змін на молекулярному рівні в процесі формування фенотипу, уміти користуватися таблицею генетичних кодів.

4. Питання для контролю засвоєння теми:

1. Ген. Визначення поняття.

2. Структура нуклеотиду ДНК.

3. Характеристика процесу реплікації ДНК.

4. Будова нуклеотиду РНК.

5. мРНК, структура і функції.

6. тРНК, будова, участь в процесі трансляції.

7. рРНК, будова та функції.

8. Відмінності в структурі і функціях між ДНК і РНК.

9. Поняття генетичного коду.

10. Властивості генетичного коду.

11. Які кодони називають нонсенс-кодонами?

12. Де у клітині відбуваються процеси транскрипції, трансляції, посттрансляційні зміни білкових молекул?

5. Тестовий контроль до практичного заняття № 5