Этап проведения ПЦР.

Как правило, выделенной ДНК недостаточно для проведения дальнейшего анализа, поэтому её количество увеличивают с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции). ПЦР характеризуется высокой специфичностью и чувствительностью, простотой и удобством проведения и сравнительно небольшими затратами. В процессе ПЦР происходит циклический синтез in vitro (в пробирке) определенного фрагмента ДНК длиной от десятков до тысяч пар оснований (п.о.). Участки ДНК, расположенные в начале и в конце этого фрагмента должны быть исходно известны. В реакционную смесь вносят два праймера-затравки, один из которых узнает «начало» фрагмента, а второй – «конец». В пробирку, кроме праймеров, добавляется смесь всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP), содержащих аденин, гуанин, тимин и цитозин (A, G, T, C). В ходе реакции происходит многократная репликация цепей фрагмента ДНК, расположенных между двумя участками, комплементарными праймерам.

Для репликации в смесь добавляют термостабильный фермент ДНК-полимеразу (DNA-pol), выделенная из термофильной бактерии Thermus aquaticus. Оптимальной для деятельности этого фермента является температура в районе +70 ⁰С. Другое важное свойство фермента – способность сохранять активность после длительной инкубации при +95⁰.

Существует несколько видов ПЦР. В практическое здравоохранение внедряется технология ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). Количественный анализ образующихся продуктов ПЦР и интерпретация полученных данных осуществляется одновременно с прохождением полимеразной цепной реакции. Такая ПЦР не требует электрофореза.

3.2.3. Этап проведения электрофореза ДНК.

Электрофорез используют чаще всего для разделения фрагментов ДНК по размеру, а также в качестве подготовительного этапа для гибридизации ДНК. При электрофоретическом разделении фрагментов ДНК возможно выявление увеличения размера изучаемой ДНК в случае возникновения у пациента инсерции, дупликации или динамической мутации при болезнях экспансии, а также уменьшение размера ДНК при делециях.

Анализ ДНК у родственников пациента с болезнью экспансии поможет выявить у них состояние премутации, при котором еще нет клинических проявлений болезни, но повышается риск рождения больного ребенка у носителя премутации. Например, при синдроме Мартина-Белла (с. ломкой Х-хромосомы) выделяют относительно здоровых членов семьи, имеющих состояние премутации в гене FMR1, выражающееся в превышении числа тринуклеотидных повторов CGG (55-200) по сравнению с нормой (29-31), но не достигающего критического значения (более 230). Таких относительно здоровых членов семьи называют нормальными «трансмиттерами», поскольку они имеют легкие клинические проявления слабой степени аутизма и умственной отсталости. Яркая картина заболевания проявляется только после достижения порогового значения числа тринуклеотидных повторов. При увеличении числа повторов (CGG) в инициаторе гена происходит необратимое метилирование инициатора и, как следствие, выключение гена. Поскольку его продуктом в норме является белок, участвующий в транспорте нейромедиатора, то данное нарушение приводит к тяжелой форме умственной отсталости, аутизму, СДВГ (синдрому нарушения внимания и гиперактивности). Существует прямая корреляция между числом повторов и тяжестью заболевания.

Электрофорез чаще всего проводят в агарозном или полиакриламидном гелях (ПААГ). Агарозные гели могут, например, иметь концентрацию 0, 85% или 1, 5%. Концентрация ПААГ может быть выше (2-18 %). Чем выше концентрация, тем меньше размер пор в геле и тем меньше размер фрагмента ДНК, который может пройти через эти поры. Гель заливают в виде пластины, которую помещают в камеру, заполненную буферным раствором. На одну контрольную дорожку геля наносят маркерную ДНК - окрашенные пробы ДНК известного размера. Через раствор пропускают электрический ток. Отрицательно заряженные фрагменты нуклеиновых кислот под действием тока движутся по гелю от катода к аноду. Более крупные фрагменты идут медленнее и остаются ближе к старту, чем более мелкие. Когда окрашенные полосы ДНК приближаются к противоположному от «старта» краю геля, ток отключают, гель помещают в раствор бромистого этидия, который связывается с ДНК и окрашивает ее в ультрафиолетовом свете длиной волны 306 нм. В агарозных гелях обычно разделяют фрагменты длиной от 100 п.о. до 60 тыс.п.о., а в ПААГ – от 100 п.о. до 1 тыс. п.о.