Культуры клеток(тканей).Определение, классификация, получение.

Культуры ткани - это клетки ткани выращенные вне организма на специальной питательной. среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональше ткани (фибробласты куриных эмбриовов, клетки человека к др., а также культуры тканей опухолей (клетки-Неla, Нер-2 и др.).

Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывает­ся из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания получен­ной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохра­няются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготов­ляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладаю­щих способностью длительно размножаться in vitro в определен­ных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки ам­ниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоид­ные клетки человека. Они представляют собой клеточную систе­му, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток использу­емой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают зло­качественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

Кулътивирование клеток может призойти в специальных флаконах (колбы-матрацы, флаконы Карреля) и в пробирках. Культура клеток для роста должна иметь какую-либо опору, например, стенку пробирки.

В выросшую культуру ткани, которая покрывает стенку сосуда в виде однослойного клеточного пласта, засевают материал, содержащий вирус. Работу производят в стерильных условиях. Для подавления роста микрофлоры вируссодержащий материал предварительно обрабатывают антибиотиками, чаще пенициллином и стрептомицином.

О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).

Питательной средой для культуры ткани могут быть различные растворы, сослав которых приближается к составу жидкости организма (синтетическая среда 199, солевой раствор Хенкса с сывороткой, гидролизат лактальбумина с сывороткой и другие).

9. Признаки размножения вирусов в курином яйце
Пока зателем заражения эмбриона вирусом может служить:
* его гибель в характерные для данного вируса сроки.
* патологоанатомические изменения, появляющие ся в различных структурах эмбриона.
Так, хорионаллантоисная оболочка (ХАО) может быть отеч ной, иметь кровоизлияния, узелки, или, как их называют, оспины(при заражении куриных эм брионов вирусами оспы птиц, инфекционного ларинготрахеита птиц, болезни Ауески и некоторыми другими) При этом размер и морфология оспин заметно различаются при размножении разных вирусов. Сам зародыш может отставать в росте и разви тии от незараженных, т. е. проявлять феномен карликовости. Тело его может быть в разной степени обезвожено или мумифицирова но, шея характерно перекручена(инфекционный бронхит кур)
Встречаются вирусы (например, штамм В, вируса ньюкаслской болезни), которые, размножаясь в куриных эмбрионах, не вызывают ни их гибели, ни патологоанатомических изменений. Обнаружить такой вирус можно лишь в том случае, если он обладает способнос тью агглютинировать эритроциты, т. е. с помощью реакции гемагглютинации (РГА). Явление гемагглютинации представляет собой со единение эритроцитов в хлопья при добавлении к ним суспензии гемагглютинирующего вируса. Гемагглютинирующими свойствами обладают те вирусы, вирионы которых имеют на поверхности рецепто ры, способные взаимодействовать с рецепторами оболочек эритро цитов
Нередко при вскрытии эмбриона не удается обнаружить ни одного признака размножения вируса, хотя он и находится в ис следуемом материале. Такой пассаж, как уже говорилось, назы вается «слепым».

10. Методы обнаружения вируса в культуре к-к
1. Цитопатический эффект
2. Реакция гемадсорбции
3. Метод цветных проб
4. Метод бляшек
5. Иммунофлуоресцентный метод
6. Реакция связывания комплемента
7. Реакция гемаглютинации
8. Заражение животных, восприимчивых к данному вирусу
9. Реакция переципитации в агаре

11. Цитопатический эффект, определение, классификация
Это дегенерация к-к, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса.
Микроскопически выражается в различных изменениях морфологии к-к, образовании гигантских многоядерных к-к(симпластов), пикнозе ядер и в полной деструкции к-к.
Макроскопически заметно слущивание к-к со стенок пробирки. Х-р клеточной дегенерации зависит от вида вируса.
Может проявляться в виде след изменений:
1. Равномерная мелкозернистая деструкция к-к(полиовирусы, вирусы Коксаки)
2. Очаговая мелкозернистая дегенерация к-к(вирус гриппа, клещевого энцефалита)
3. Гроздевидная (аденовирусы)
4. Крупнозернистая равномерная деструкция к-к(вирус герпеса)
5. Симпластообразование(респираторно-синуитиальный вирус, вирус кори)

12. Методы типирования вирусов
Определение типа вирусов в виртсодержащем материале основано на нейтрализации вируса типоспецифическими сыворотками. Конечный результат может быть установлен на основании след признаков:
1. Нейтрализация Цитопатического действия
2. Нейтрализация реакции гемадсорбции
3. Изменение, проявление цветной пробы.
4. Задержка реакции гемаглютинации
5. Нейтрализация в опытах на животных
6. Свечение к-к сод вирус, под влиянием типоспецифических флуоресцирующих сывороток.