Діагностика та ідентифікація вірусів.

Метод рослин-індикаторів та електронна мікроскопія. Їх різновидності. Імунологічні властивості вірусів. Поняття реакції антиген-антитіло на прикладі вірусних патогенів. Серологічні методи в фітовірусології. Пріоритет та недоліки. Модельна система отримання антитіл до фітовірусів. Моно- та поліклональні антитіла. Полімеразна ланцюгова реакція.

Метод рослин – індикаторів передбачає використання чутливих рослин до механічної інокуляції в них вірусу. Як правило, легше механічно заразити вірусом трав’янисту рослину, ніж деревну культуру, дводольну ніж однодольну, молоді проростки, ніж старі. Робота із вірусом, як із модельною системою, передбачає постійне підтримання його в активному стані. Для цього досліднику необхідно підбирати такі рослини, які після штучного зараження досить довго зберігають в собі вірус, проявляють на собі зовнішні симптоми вірусного ураження, накопичують його у великих кількостях та концентраціях та рослини, які придатні до оцінки інфекційності вірусу, яку проводять шляхом підрахунку первинних пошкоджень (локальних пошкоджень в інокульованих листках). Для цієї мети підбирають різні види рослин. Наприклад, вірус мозаїки люцерни можливо зберігати довгий час на люцерні, але надзвичайне його розмноження можна отримати на рослинах тютюну, а для діагностичної оцінки інфекційності краще використовувати листки квасолі звичайної, а характерні симптоми, що відрізняють його від інших вірусів, з’являються на 37 тютюну, квасолі та лободі Chenopodium amaranticolor. Тим самим, використовуючи метод рослин-індикаторів та фіксуючі зовнішні специфічні симптоми ураження, можна діагностувати різний рослинний матеріал на ураження вірусами. Наступним ефективним діагностичним методом в вірусології являється метод електронної мікроскопії. Електронний мікроскоп являється найбільш використовуємим приладом для вірусологів, і нажаль самим коштовним. Те, що віруси можливо побачити тільки за допомогою пучка електронів було визначено ще у 1873 році Ернстом Аббе, який відмітив про те, що розрішаюча спроможність світлового мікроскопу залежить від апертури лінз його об’єктиву та довжини хвилі світла. По скільки навіть при максимальній апертурі розрішаюча спроможність не перевищувала навіть половини довжини хвилі світлової хвилі, то за допомогою світлового мікроскопу можливо було побачити тільки віруси із родини Poxviridae, наприклад вірус осповакцини (його розміри 300х200 нм). Використовуючи видимий пучок електронів замість видимих променів, теоретично можливо отримати більше розрішення. І це дійсно так. Електронні мікроскопи досягають значень 0, 2 – 0, 4 нм розрішаючою спроможності, чого являється достатньо для вивчення структури та будови багатьох біологічних макромолекул. Отриманий тим чи іншим шляхом пучок електронів в електронному мікроскопі прискорюється за допомогою високої напруги і тоді фіксується системою електростатичних чи електромагнітних луп. В системі мікроскопу підтримується високий вакуум, і тому такі летючі речовини як вода випаровуються. Саме тому необхідно спеціально виготовляти електронно- мікроскопічні препарати із певною концентрацією в них об’єктів (наприклад для вірусів 1 млрд часток на 1 мл). Зразок спостерігається під електронним мікроскопом тому, що він розсіює або приломлює чи змінює фазу прохідного через нього електронного променю, який тоді реєструється за допомогою флуоресцентного екрану, фотоемульсії або детектору електронів. Відомо багато різновидновидностей електронної мікроскопії, як одного із ефективних методів діагностики рослинного матеріалу на вірусоносійство. Але наряду із прислівом: “ Краще один раз побачити, ніж почути”, не слід забувати про те, що іноді можливо і не побачити вірус в пробі, коли він там буде знаходитись. Справа в концентрації препарату. Іноді метод електронної мікроскопії не може являтись направляючим у варіанті експрес-діагностики. Але все ж таки, коли вірус спостерігається в полі зору, питання про його присутність в матеріалі автоматично знімається. В іншому випадку, коли дослідник має справу із невеликими концентраціями патогенів в досліджуємому матеріалі, своє вагоме слово мають імунологічні методи досліджень. Імунологія – це наука про імунітет. Вона вивчає механізми та шляхи управління імунітетом, а також розробляє імунологічні методи діагностики, 38 лікування та профілактики захворювань. Основоположниками імунології прийнято рахувати англійського лікаря Дженнера (1749 – 1823) та Луі Пастера, який в 1881 році зробив повідомлення про те, що у випадку зараження курей ослабленим збудником холери курей, вони стають стійкими у варіанті зараження високовірулентними культурами. Звідси і пішло вчення вакцинації (вакка – корова), названої Пастером на честь Дженнера, який працював із коров’ячою віспою багато років тому. Трохи пізніше, імунологія набуває широкого розвитку. Із таким пов’язано відкриття І.І. Мечниковим в 1883 році теорії фагоцитозу та вчення про клітинний імунітет та теорії гуморального імунітету, сформульованої Ерліхом. В 1908 році їм була присуджена Нобелівська премія, як фундаторам сучасної імунології. Імунологія складається із двох великих взаємопов’язаних розділів. Перший – вчення про імунну систему організму, тобто про таку реагуючу систему, що дозволяє розпізнати генетично чужорідних речовин. Як раз вона забезпечує імунітет – захист від вірусів, бактерій, паразитів, елімінацію (виведення) відмираючих та мутаціонно змінившися власних клітин тіла. Другий розділ імунології – вчення про антигени, тобто о структурі та властивостях біологічних субстанцій, які являються чужерідними для організму, і призводять до виробки на них клітин – антитіл, що їх нейтралізують. Головне питання, що виникає у випадку вірусного процесу, це як проходить інфікування та послідуюча інактивація вірусу в організмі, вірус як антиген, і як виробляються проти нього антитіла? Імунітет при вірусних інфекціях, як відомо, забезпечується антитілами та сенсибілізованими Т-лімфоцитами. До речі, у випадку вірусів, що циркулюють в крові, то останні можуть бути знешкоджені та виведені із організму механізмами гуморального імунітету. Антитіла інактивують вірус блокуючи перші етапи взаємодії із клітиною – адсорбція та проникнення. Вони ж інактивують також токсичні властивості вірусу. Стабільність комплексу вірус – антитіло залежить від різновидностей чутливості вірусу до антитіла – їхньої авидності, температури та часу контакту тощо. Нерідко сполучення вірусу із антитілом має зворотній характер, тобто вірус спроможен зберігати свої біологічні властивості після роз’єднання із антитілом. Важливо знати, що антитіла не спроможні спричинити вплив на вірус, що знаходиться в нутрі зараженої клітини. В цьому випадку в організмі синтезуються цитотоксичні Т-лімфоцити, які спроможні лізувати тільки вражені вірусом клітини. Звідси, із-за внутрішньоклітинного розмноження вірусів, вагома частка належить клітинному імунітету. Крім сенсибілізованих Т-лімфоцитів при проникненні вірусів в клітини включаються К-кіллери та природні кіллери, особливо при вірусних інфекціях типу грипп та парагрипп, що мають короткий інкубаційний період. Слід також зауважити, що деякі віруси не дивлячись на імунну відповідь постійно персистують в організмі хазяїну (наприклад вірус 39 герпесу). Вони інтегруються в геном клітини без прояву клінічних симптомів. Надзвичайно цікавий факт про те, що віруси рослин попадаючи в організм тваринного походження також викликають процес синтезу антитіл. Направляюча теорія по активації цього процесу досить не погано описана. Вірусний антиген являється чужорідним по відношенню до головного комплексу гістосумісності, навіть коли він уражає в умовах in vivo рослину. Зразу ж після його попадання в організм проходить вироблення імуноглобулінів, яких відомо п’ять видів – M, G, A, D та Е, і які відрізняються по віку життя в організмі. Перші із них самі короткоживучі – від декількох годин до декількох днів, інші спроможні жити роками в організмі, виступаючи в ролі постійного і стабільного імунітету. Вся теорія виробки антитіл полягає в синтезі специфічних клітин, що своїми реакційними центрами (епітопами) блокують антигенні детермінанти по принципу зв’язування фермент – субстрат, ключ до замку. Тобто синтез антитіл відбувається згідно зовнішньої будови вірусів, його морфологічних ознак. Навіть невеликі зміни в будові вірусних капсидів потребують синтезу специфічних антитіл, які будуть визначатись вірусспецифічністю і будуть встановлювати штамоспецифічність навіть у одного і того ж роду вірусу, що визнано називати ізолятами даного вірусу. Введення вірусу в організм викликає синтез імуноглобулінів типу М, повторне введення посилює імунну відповідь організму і спричиняє виробку імуноглобулінів інших типів, які більш стійкіші. Постає питання, що ж таке реакції імунітету? РІ – це реакції між антигеном та антитілом або між антигеном та сенсибілізованими лімфоцитами, які проходять в живому організмі та спроможні до проведення в умовах in vitro. Реакції між АГ та АТ називають серологічними (від грецької – серум – сироватка) або гуморальними (від латинської – гумор – рідина). Реакції АГ із сенсибілізованими лімфоцитами називають клітинними. В вірусології та фітовірусології зокрема розрізняють багато видів та модифікацій серологічних реакцій, які направлені на діагностику, ідентифікацію та виявлення навіть у супермалих концентраціях вірусів в патологічному матеріалі. Для фітовірусології відомо досить велику низку серологічних методів. Так, в 1977 році два вчених Кларк та Адамс запропонували світу використання імуноферментного аналізу (ІФА) для детекції фітовірусів. Цей метод дуже чутливий і спроможен зафіксувати вірусний антиген навіть якщо його концентрація складає 0, 3 г/кг патологічного матеріалу (наприклад листків, що уражені вірусом). Розглянемо основні і широко використовуємі серологічні методи в вірусології. Слід також зауважити про існування моноклональних антитіл – АТ, які можливо отримати з'єднанням клітини міеломи із В-лімфоцитами із 40 селезінки миші, імунізованої специфічним антигеном. В результаті отримують гібридні клітини (гібридоми), які певний час продукують високоспецифічні антитіла одного типу (МКА). Їх можливо використовувати із лікувально-профілактичною метою при деяких інфекційних захворюваннях. На прикінці лекції, необхідно зауважити про пріоритети та недоліки використання серологічних реакцій. До пріоритетів слід віднести високу чутливість та специфічність методів при детекції вірусних антигенів, швидкість визначення присутності антигену в пробі та його ідентифікації. До недоліків можна віднести високу коштовність у варіанті отримання МКА, та реактивів для проведення серологічних методів. Також існує ціла низка артефактів при проведенні ІФА, коли є варіант зв’язування АТ2 із присутньою в рослині в нормі пероксидази. Слід робити висновок про присутність того чи іншого вірусу в пробі спираючись на різні варіанти серологічних реакцій, а також на результати по зараженню рослин-індикаторів, електронної мікроскопії тощо.

8.1 Полімеразно-ланцюгова реакція.

Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) був розроблений Кері Мюллисом в 1983 році. Відкриття ПЛР стало однією з найбільш видатних подій в області молекулярної біології за останні 20 років. За розробку ПЛР-аналізу К. Мюллис в 1993 році був удостоєний Нобелівської премії в області хімії. Поява методу ПЛР була обумовлена певними досягненнями в області молекулярної генетики, передусім розшифровкою нуклеотидної послідовності геномів ряду мікроорганізмів. Не можна також не сказати, що ПЛР стала можливою завдяки відкриттю унікального ферменту taq -ДНК-полимеразы, що міститься у бактерій, що мешкають в гейзерах. Особливість цього ферменту полягає в його винятковій термостійкості (період напівжиття при 95О і складає 40 хвилин) і високій робочій температурі - оптимум роботи 72ОС. Витонченість, простота виконання, неперевершені показники чутливості і специфічності принесли новому методу небувалу популярність. За короткий час ПЛР-аналіз поширився по всьому світу. Діагностика інфекційних захворювань, у тому числі викликаних важко культивованими агентами, генотипування мікроорганізмів, оцінка їх вірулентності, визначення стійкості мікрофлори до антибіотиків, пренатальна діагностика біологічний контроль препаратів крові - ось неповний перелік напрямів медицини, де з успіхом застосовується ПЛР.

8.2Принцип методу полімеразної ланцюгової реакції.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - метод ампліфікації ДНК in vitro, за допомогою якого протягом декількох годин можна виділити і розмножити певну послідовність ДНК в мільярди разів. Можливість 41 отримання величезної кількості копій однієї строго певної ділянки генома значно спрощує дослідження наявного зразка ДНК. У основі методу ПЛР лежить природний процес - добудовування комплементу ДНК матриці, здійснюване за допомогою ферменту ДНК- полімерази. Ця реакція носить назву реплікації ДНК.

Природна реплікація ДНК включає декілька стадій:

1) Денатурація ДНК (розплітання подвійної спіралі, розбіжність ниток ДНК);

2) Утворення коротких дволанцюгових ділянок ДНК (затравок, необхідних для ініціації синтезу ДНК);

3) Синтез нового ланцюга ДНК (добудовування комплементу обох ниток) Відкриття термостабільної ДНК-полимеразы (Taq -полимеразы) з термофільних бактерій Thermis aquaticus, оптимум роботи якої знаходиться в області 70-72 градусів, дозволило зробити процес реплікації ДНК циклічним і використовувати його для роботи in vitro. Створення програмованих термостатів (амплификаторов), які за заданою програмою здійснюють циклічну зміну температур, створило передумови для широкого впровадження методу ПЛР в практику лабораторної клінічної діагностики. При багатократному повторенні циклів синтезу відбувається експоненціальне збільшення числа копій специфічного фрагмента ДНК, що дозволяє з невеликої кількості аналізованого матеріалу, який може містити одиничні клітини мікроорганізмів отримати достатню кількість ДНК копій для ідентифікації їх методом електрофорезу. Добудовування комплементу ланцюга починається не в будь-якій точці послідовності ДНК, а тільки в певних стартових блоках - коротких двониткових ділянках. При приєднанні таких блоків до специфічних ділянок ДНК можна спрямувати процес синтезу нового ланцюга тільки в цій ділянці, а не по усій довжині ДНК ланцюга. Для створення стартових блоків в заданих ділянках ДНК використовують дві олигонуклеотидные приманки (20 нуклеотидных пара), звані праймерами. Праймери комплементарны послідовностям ДНК на лівій і правій межах специфічного фрагмента і орієнтовані таким чином, що добудовування нового ланцюга ДНК протікає тільки між ними. Для отримання достатньої кількості копій шуканого характеристичного фрагмента ДНК ампліфікація включає декілька (20-40) циклів. Таким чином, ПЛР є багатократним збільшенням числа копій (ампліфікація) специфічної ділянки ДНК що каталізує ферментом ДНК- полимеразой. Для проведення ампліфікації потрібні наступні компоненти:

1 етап: Денатурація ДНК (розплітання подвійної спіралі). Протікає при 93-95 градусах протягом 30-40 сек.

2 етап: Приєднання праймерів (відпал). Приєднання праймерів відбувається комплемент арно до відповідних послідовностей на протилежних ланцюгах ДНК на межах специфічної ділянки. Для кожної пари праймерів існує своя температура відпалу, значення якої розташовуються в інтервалі 50-65 градусів. Час відпалу - 20-60 сек.

3 етап: Добудовування ланцюгів ДНК. Добудовування комплементу ланцюгів ДНК походить від 5-конца до 3 -концу ланцюга в протилежних напрямах, починаючи з ділянок приєднання праймерів. Матеріалом для синтезу нових ланцюгів ДНК служать ті, що додаються в розчин дезоксирибонуклеотидтрифосфати (дНТФ). Процес синтезу каталізує ферментом термостабільною ДНК-полімеразою (Taq-полимеразою) і проходить при температурі 70-72 градусів. Час протікання синтезу - 20-40 сек.

8.4 Переваги методу ПЛР як методу діагностики інфекційних захворювань.

1. Пряме визначення наявності збудників. Багато традиційних методів діагностики, наприклад иммуноферментный аналіз, виявляють білки-маркери, що є продуктами 44 життєдіяльності інфекційних агентів, що дає лише опосередковане свідоцтво наявності інфекції. Виявлення специфічної ділянки ДНК збудника методом ПЛР дає пряма вказівка на присутність збудника інфекції.

2. Висока специфічність. Висока специфічність методу ПЛР обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється унікальний, характерний тільки для цього збудника фрагмент ДНК. Специфічність задається нуклеотидной послідовністю праймерів, що унеможливлює отримання помилкових результатів, на відміну від методу иммуноферментного аналізу, де нерідкі помилки у зв'язку з перехресно-реагуючими антигенами.

3.Висока чутливість Метод ПЛР дозволяє виявляти навіть одиничні клітини бактерій або вірусів. ПЛР-діагностика виявляє наявність збудників інфекційних захворювань в тих випадках, коли іншими методами (імунологічними, бактеріологічними, мікроскопічними) це зробити неможливо. Протягом декількох годин за допомогою ПЛР з одного фрагмента молекули ДНК можна отримати більше 50 млрд. ідентичних молекул. Таким чином, можна вивчити генетичний матеріал присутній в крихітних кількостях. Чутливість ПЛР-аналізу складає 10-100 клітин в пробі (чутливість імунологічних і мікроскопічних тестів - 1000-100000 клітин).

4.Универсальність процедури виявлення різних збудників. Матеріалом для дослідження методом ПЛР служить ДНК збудника. Метод заснований на виявленні фрагмента ДНК або РНК, що є специфічним для конкретного організму. Схожість хімічного складу усіх нуклеїнових кислот дозволяє застосовувати уніфіковані методи проведення лабораторних досліджень. Це дає можливість діагностувати декілька збудників з однієї біопроби. Як досліджуваний матеріал можуть використовуватися різні біологічні виділення (слиз, сеча, мокрота), соскобы епітеліальних клітин, кров, сироватка.

5. Висока швидкість отримання результату аналізу. Для проведення ПЛР-аналізу не вимагається виділення і вирощування культури збудника (як культуральні методи), що займає велику кількість часу. Уніфікований метод обробки біоматеріалу і детекции продуктів реакції, і автоматизація процесу ампліфікації дають можливість провести повний аналіз за 4-4.5 години.

6. Можливість діагностики не лише гострих, але і латентних інфекцій. Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важко культивованих, некультивованих і персистирующих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися при латентних і хронічних інфекціях, оскільки цей метод дозволяє уникнути складнощів, пов'язаних з вирощуванням таких мікроорганізмів в лабораторних умовах. Застосування ПЛР-діагностики також дуже ефективно відносно збудників з високою антигенною мінливістю і внутрішньоклітинних паразитів.45 Слід зазначити що методом ПЛР можливе виявлення збудників не лише в клінічному матеріалі, отриманому від хворого, але і в матеріалі, що отримується з об'єктів зовнішнього середовища (вода, грунт і так далі). Прості вимоги до умов зберігання транспортування матеріалу від пацієнта в лабораторію не вимагають збереження збудника в живому виді, в порівнянні з бактеріологічними і вірусологічними методами.

8.5 Обмеження методу ПЛР.

Перехресна контамінація від проби до проби (в процесі обробки клінічних зразків або при розкопуванні реакційної суміші), що призводить до появи спорадичних псевдопозитивних результатів; контамінація продуктами ампліфікації (ампликонами), що має найбільше значення, оскільки в процесі ПЛР ампликоны накопичуються у величезних кількостях і є ідеальними продуктами для реамплификации. Контамінація слідовими кількостями ампликонов посуду, автоматичних піпеток і лабораторного устаткування, поверхні лабораторних столів або навіть поверхні шкіри співробітників лабораторії приводить до появи систематичних псевдопозитивних результатів. Як правило, визначити джерело контамінації буває дуже важко і вимагає значних витрат часу і засобів. Накопичений до теперішнього часу досвід роботи лабораторій що використовують метод ПЛР для діагностики дозволяє сформулювати основні вимоги до організації таких лабораторій і проведення самих аналізів. Дотримання цих вимог дозволяє унеможливити контамінації і отримання псевдопозитивних результатів.

ПЛР - дослідження включає 3 стадії:

- виділення ДНК із зразків;

- проведення полімеразної ланцюгової реакції;

- реєстрація результатів (методом електрофорезу в агарозном гелі та ін.)

іщуючи їх в окремих приміщеннях: Пре-ПЛР-приміщення, де здійснюється обробка клінічних зразків, виділення ДНК, приготування реакційної суміші для ПЛР і постановка ПЛР (за наявності умов два останні етапи рекомендується також проводити в додатковому окремому приміщенні). У цих приміщеннях забороняється проводити усі інші види робіт з інфекційними агентами ПЛР-діагностика яких проводиться в цій лабораторії. Пост-ПЛР-приміщення, де проводиться детекция продуктів ампліфікації. У цьому приміщенні допускається використовувати інші методи детекции інфекцій. Бажано кімнату детекции продуктів ампліфікації розташувати якнайдалі від пре-ПЛР-помещений.