Закономірності імунної відповіді. Фази імунної відповіді. Імунологічна пам'ять, її механізм. Теорії імунітету.

Динаміка утворення антитіл залежить від сили антигенного впливу (дози антигену), частоти впливу антигенного стану організму і його имунной системи. При первинному і повторному введенні антигену динаміка антителообразования також різна і протікає в кілька стадій. Виділяють латентну, логарифмічну, стаціонарну фазу зниження. У латентній фазі відбуваються переробка і представлення антигену иммунокомпетентным кліткам, розмноження клону кліток спеціально на вироблення антитіл до даного антигену, починається синтез антитіл. У цей період антитіла в крові не виявляються. Під час логарифмічної фази синтезовані антитіла вивільняються з плазмоцидів і надходять у лімфу і кров. У стаціонарній фазі кількість антитіл досягає максимального і стабілізується, потім настає фаза зниження рівня антитіл. При первинному введенні антигену (первинна імунна відповідь) латентна фаза складається 3-5 доби, логарифмічна -7-15 доби, стаціонарна - 15-30 доби і фаза зниження - 1-6 місяців і більш. Спочатку синтезуються Іg, а потім Іg. При вторинному введенні антигену (вторинна імунна відповідь) латентний період укорочений до декількох чи годин 1-2 доби, логарифмічна фаза характеризируется швидким наростанням і значно більш високим рівнем антитіл, що в останніх фазах довгостроково утримується і повільно в плині декількох років знижується. Синтезуються головним чином Іg. Після первинного введення антигену в имунной системі формується клон лімфоцитів, що несуть імунологічну пам'ять про даний антиген. І.Теорія Ерліха-т.бічних ланцюгів (1898) Ерліх вважав, що клітини мають різні рецептори. Аг зєднується з ними і блокує їх. Клітини утв з ними велику кількість рецепторів і це будуть АТ, що потрапляють у кров. ІІ.У 1937р Ландшейнер висунув ідею про частку АГ в утворенні специфічних глобулінів. Ії розвивали Полінг, Гауровець- створили т.прямої матриці або інструктивну т. (АГ-інструктор матриці, на якій молекулиглобуліну набувають специфічності). ІІІ. У 1949р Бернет і Фенер- т. непрямої матриці. АГ включається в геном клітини, а потім контролює синтез глобулінів. ІV. У 1955 р Йєрне- т. природного добору: АГ виступає в ролі селектора. У 1964р Бернет- клонально-селекційна т. Основні положення 1.популяції лімфоцитів в організмі дуже численні- 10¹²-10¹⁴ Вони гетерогенні і скл з кланів (приблизно 10000 кланів(колоній))2.АГ з селективним чинником, він звязується специфічними рецепторами з лімфоцитами і відбирає певну колонію, яка присутня для деференціації 3 кожна АТ продукуюча клітина синтезує один вид АТ 4 надлишок АГ знищує специфічну колонію, а це пояснює ІТ. V У 1987р Тенегава створив т. утворення АТ-виконана на молекулярному та генетичному рівні Основні принципи 1 з клітин мезенхіми утв багато колоній і культур клітин, вони можуть реагувати з різними рецепторами АГ. 2 клітини- продуценти АТ мають рецептори які закодовані в хромосомах. Кожна клітина-продуцент АТ звязується з АГ і викликає проліферацію В-лімфоцитів 3. після проліферації В-лімфоцитів відбувається їхня диференціація і продукція АТ які надходять у кров.

33. Серологічні реакції, їх характеристика, основні типи. Реакції аглютинації, преципітації, зв’язування комплементу, їх суть, значення. Закономірності СР: взаємодія АГ і АТ строго специфічно, СР проходить при адекватних (визначених) співвідношеннях кількості АГ і АТ, СР мають двухфазний характер, специфічна взаємодія-фаза " невидима", утворення видимих комплексів-для цього додають фізіологічний розчин, СР проходить по типу фізико-хім колоїдної реакції, СР оборотні, виділяється невелика к-сть тепла (слабко екзотермічний) Цілі використання СР: І серологічна ідентифікація – визначення виду невідомого АГ за допомогою відомих АТ: а) невідомі АГ-МіО патогенні і непатогенні, токсини різного походження, білки крові, клітини різних органів і тканин іншого виду або групи крові, клітини трансплантанта, б)відомі АТ- стандартні препарати імунні діагностичні сироватки ІДС. ІІ серологічна діагностика-визначення невідомих АТ за допомогою відомих АГ-діагностикумів: 1.невідомі АТ-сироватки крові людей- хворих, що перехворіли, носіїв, вакцінованих, 2. діагностикум-стандартні препарати, що одержують з чистих культур МіО певних видів або АГ. МіО вирощують, потім стандартизують (кількість мікробів-одиниця обєму) та убивають або інактивують температура Т, формалін, спирт і ін. Діагностикум втрачає патогенність але зберігає АГ-ні властивості. Види СР: 1. реакція аглютинації (РА) склеювання великих корпускулярних АГ під дією специфічних АТ. АГ в РА наз аглютикоген а АТ-аглютинін. Комплекс-аглютинат.Механізм РА: при взаємодії АГ-детермінанти активних центрів АТ утворюється комплекс по типу решітки. Вони видимі в присутності електроліту (фізіологічний розчин)

Використовують для визначення антитіл у сироватці крові хворих при черевному тифі і паратифах. 2.реакції преципітації (РП) –осадження мілкодисперсного АГ або розчинного АГ під дією специфічних АТ (АГ-преципітоген, АТ-преципітин, комплекс-преципітат). Ризновиди реакції аглютинаціїреакція непрямий гемаглютинації: 1. РНГА- викоирстовується в тому випадку, якщо АГ розчинний або дуже дрібний. У ролі АГ застосовують еритроцитний діагностикум, АГ-досліджувана сироватка крові. При взаємодії АГ і АТ відбувається склеювання еритроцитів і випадання в осад. Його краї будуть нерівними. У нормі еритроцити утв осад з рівним краєм. 2. РОНГА – у цьому випадку на еритроцитах адсорбують АТ. а) реакція лізиса – трикомпонентні реакції, проходять між АГ і АТ у присутності Со. У результаті утв комплекс АГ-АТ, з ним звязується Со та відбувається лізис АГ. Лізис різних АГ: бактерій-бактеріоліз, вірусів- вірусоліз, клітин-цитоліз, невидимий виняток-лізис еритроцитів-гемоліз. При гемолізі в результаті руйнації еритроцитів з них виходить гемоглобін. Ми бачимо прозору червону рідину-наз. лаковою кровю Якщо немає гемолізу-у пробірці буде осад еритроцитів. Реакція зв'язування комплементу широко використовується з метою сер. діагностики інфекційних хвороб. Досліджувана сироватка прогрівається при 56° для інакти­вації власного комплементу. У пробірку вносять цю сироватку, від­повідний антиген і комплемент у робочій дозі, встановленій зазда­легідь. Реакція відбувається в термостаті, хоча можливі й інші тем­пературні режими. Якщо в досліджуваній сироватці є антитіла, вони зв'язуються з антигеном і фіксують комплемент. Проте, у цій фазі не наступає видимих змін, тому у другій фазі виявляють результат реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана й гемолітична сироватка). Якщо у другій фазі гемоліз не на­ступив, це означає, що комплемент зв'язався у першій фазі реакції, тобто в досліджуваній сироватці є антитіла (реакція позитивна). Якщо ж у результаті реакції наступив гемоліз — реакція негативна, антитіл у досліджуваній сироватці немає (в першій фазі не відбулось реакції між антитілами й антигеном і не зв'язався комплемент).

РЗК використовують також для виявлення антигенів, у цьому разі необхідна імунна діагностична сироватка з відомими ан­титілами.

34. Імунні сироватки, класифікація, одержання, контроль, практичне використання. Промислове виробництво. Імунні сироватки-препарати із сироваток тварин і людей утримуючі антигени. Класифікація: 1. лікувально-профілактичні а) антитоксичні і антибактеріальні (протидифтерійна, протиправцева, протиправцевий імуноглобулін, противогангренозна, глобулін проти сибірки, протистафілококовий імуноглобулін) б) антивірусні (імуноглобулін проти кору, антирабічний γ -глобулін, противісповий імуноглобулін, протигрипозний імуноглобулін, проти вірусу кліщового енцефаліту) 2. діагностичні для ідентифікації бактеріальних інфекцій (аглютинуючі, преципітуючі, лізуючі). 3. для ідентифікації вірусів (віруснейтралізуючі, комплементозвязуючі, антигемаглютинуючі) Види ІС: 1.ІС які використовуються для розгорнутих СР, тобто їх розводять до титру, 2.адсорбованіІС- містять АТ строго визначеної специфічності. Інші – близькі АТ, забирають шляхом обробки сироватки різними АГ.Це наз вичерпанням сироватки. Адсорбовані ІС використувують для СР на склі. Контроль: на стерильність, відсутність шкідливості, специфічну активність (імуногенність) реактогенність (на лаб твар або добровольцях), онкогенність. Подвійний контроль (в спец інституті та на заводі) Отримання: імунізація тварини (вибір тварини залежить від віз запланованої кількості сироватки) відомими АГ-багато разів, гіперімунізація, узяття крові, одержання сироватки, визначення АТ у сироватці за допомогою СР з АГ, яким проводимо імунізацію, визначення титру АТ –невелике розведення сироватки, при якому відбувається СР, стандартізація і маркування сироватки-чия сироватка, які містить АТ, титри АТ і для якої мети СР. Сила антитоксичних сироваток вимірюється в міжнародних одиницях. МО- це та найменша кількість антитокс сироватки, яка нейтралізує певну кількість екзотоксину в організмі певного виду з певною масою. МО дифтерійної антитоксичної сироватки –та найменша к-сть її яка нейтралізує 100Dlm дифтерійного екзотоксину в організмі морської свинки вагою 250 г. МО правцевої АС-та найменша к-сть її, яка нейтралізує 1000Dlm правцевого екзотоксину в організмі морської свинки вагою 350 г. МО правцевої АС-та найменша к-сть її, яка нейтралізує 10Dlm правцевого екзотоксину в організмі білої миши вагою 18-20 г.

35.Антитоксини, їх класифікації, механізм дії, принцип одержання ант сироваток. Одиниці виміру практичне використання Антитоксини-антитіла к-рі утворяться в організмі тварин і людини у відповідь на появу токсинів мікробного чи тваринного походження, є могутнім чинником антитоксичного імунітету. Антитоксини застосовуються у виді антитоксичних сироваток: (протидифтерійна, протиправцева протистобнячний імуноглобулін, протигангренозна, глобулін проти сибірки, протистафилококовий імуноглобулін). Зміст антитоксину в антитоксичних сироватках виражається в антитоксичних одиницях. Антотокс сиров готують шляхом імунізації тварин мікробними екзотоксинами і використовують для профілактики і лікування (столбняк, ботулізм, гангрена, дифтерія, стафілоккокові і стрептоккові інфекції) Також сюди відносяться сироватки проти отрут змій. В даний час більшість сироваток випускається в очищеному концентрованому виді, це дозволило знизить кількість і тяжкість побічних реакцій котрі розвиваються при введенні в організм білкових субстанцій.

36. Гіперчутливість негайного (ГНТ) і уповільненого (ГУТ) типу їх механізм відмінності. Антиалергійні препарати Т-залежні або клітинні реакції – приклад гіперчутливість сповільненого типу (ГЧУТ), клінічні форми – контактний дерматит, відторгнення трансплантата. Механізм ГЧУТ: 1. Імунологічна стадія – під впливом сенсибілізуючої дози АГ виникає сенсибілізація Т-л.ф., потім відбувається їхня проліферація, в організмі утв колонії сенсибілізованих Т л.ф, 2. патохімічна – після введення дозволяючої дози АГ у лімфоцитах відбувається активація ферментів лізосом, нестаболітичних процесів і виділення клітинних медіаторів – лімфотоксинів; 3. патофізіологічна –виділення Т-ефекторами і Т-кілерами лімфокинів, що руйнують клітини. До цього процесу приєднуються макрофаги, розвиваються запальні реакції. Стан сенсілібації зберігається протягом усього життя і зустрічається при туберкульозі, бруцельозі, й інших захворюваннях. Порівняння

Механізм: ГНТ зв'язаний з виробленням антитіл, а ГУТ із клітинними реакціями. ГНТ вперше описана Рише, Портье і Сахаровим. Установлено що ГНТ виникає при утворенні комплексу антиген-антитіло і дії цього комплексу на чуттєві клітки. Виявляється: в анафілаксії, сироватковій хворобі. ГУТ вперше описана Кохом. Ця форма прояву не зв'язана з антитілами, опосередкована клітинними механізмами за участю Т-лімфоцитів. До ГУТ відносяться: контактна алергія, уповільнена алергія до білок, туберкулінова реакція. Антиалергічні препарати: Диазолин, супрастин, гистамин, натрію тіосульфат.

37. Гібридомна технологія, моноклональні антитіла. Моноклональні антитіла — це препарати антитіл, високоспецифічні до однієї антигенної детермінанти, одержані з одного клону клітин-продуцентів іп уііго. Продуцентами моноклональних антитіл є гібридоми — клітини, одержані шляхом злиття лімфоцита та мієломної клітини. Лімфоцит, як високодиференційована клітина, продукує антитіла однієї специфічності in virto, але не розмножується. Мієломна клітина, що походить із злоякісної пухлини, має здатність до безмежного розмноження. Гібридомна ж клітина розмножується, утворюючи клон, який продукує антитіла.

Етапи одержання моноклональних антитіл:

1. Імунізація тварин певним антигеном.

2. Одержання лімфоцитів від імунізованої тварини.

3. Одержання гібридом. Лімфоцити поодинці розміщують у мік-рокамерах спеціальних панелей і додають мієломні клітини. Завдяки дії спеціального " ферменту злиття" або інших речовин, що впливають на клітинні мембрани, утворюються гібридні клітини. При цьому застосовують спеціальне інкубаційне середовище, в якому ні лімфоцит, ні мієломна клітина не виживають, а гібридома розмножується.

4. Відбір гібридом, які продукують потрібні антитіла. Досліджуючи наявність потрібних антитіл у культуральній рідині, відбирають необхідний клон.

5. Вирощування клону в промислових біотехнологічних умовах і одержання комерційних препаратів моноклональних антитіл.

Як правило, діагностичні моноклональні антитіла випускають міченими радіоізотопом або ферментом. Застосовують їх для виявлення антигенів, коли важливо уникнути перехресних реакцій із близькими антигенами. У мікробіології сфера їх застосування — ідентифікація бактеріальних, вірусних та інших антигенів. У неін-фекційній імунології — виявлення поліпептидних та білкових гормонів (наприклад, рання діагностика вагітності на основі' виявлення гормону гонадотропіну в сечі). Важливе значення має застосування моноклональних антитіл для ранньої діагностики злоякісних пухлин на основі виявлення " ракових" антигенів, розроблені спеціальні тест-системи для діагностики раку кишкового тракту, пухлин жіночих статевих органів та ін.

38. Р-ї з міченими антитілами і антигенами. Суть і практичне і використання р-ї імунофлуоресценціі, імуноферментного і радіоімунологічного аналізу. Імунофлуоресценція. Позитивні результати реакцій аглютинації, преципітації, лізису, РЗК й інших спостерігають тільки при оптимальному співвідношенні реагентів. Якщо ця умова не виконується, зафіксувати видимий позитивний результат не завжди вдається.

Чутливість імунологічних реакцій значно зростає завдяки використанню мічених реагентів, наприклад, антитіл, кон'югованих з флуохромом. При зв'язуванні таких імуноглобулінів з антигеном в люмінесцентному мікроскопі спостерігають світіння об'єктів (бактерій, вірусів, клітин), покритих міченими антитілами. Імуно-флуоресцентним методом можна також визначати антитіла в сироватці хворого, на поверхні клітин і тканин. У цьому випадку використовують мічені флуоресцеїном сироватки проти глобулінів людини (антиглобулінові), якими обробляють комплекс антиген-антитіло. Внаслідок цього він під дією ультрафіолетових променів починає світитись зеленим світлом.

Імунофлуоресцентні методи вживаються для виявлення аутоантитіл до тканинних і клітинних антигенів. Використовуючи зрізи тканин, на предметному склі можна виявити антитіла до декількох різних антигенів.

З допомогою імунофлуоресцентних методів можна ідентифікувати окремі клітини в суспензії клітин з допомогою виявлення антигенів на поверхні живих клітин. Для цього суспензію живих клітин, які були попередньо пофарбовані флуоресцентними барвниками, пропускають через спеціальний прилад (цитофлуори-метр), який заміряє інтенсивність світіння кожної клітини в різних областях спектра і потім розділяє клітини за параметрами світіння.

В імуноферментних методах антиген взаємодіє з антитілом, при цьому один з реагентів зв'язаний з ферментом. Для виявлення цієї ензимної мітки необхідний відповідний субстрат (хромоген), який реагує в місці з'єднання антигена і антитіла з кон'югованим ферментом, змінюючи забарвлення реагуючої суміші.

Для такої мітки широко використовується фермент пероксидаза хрону, яка залежно від субстрату дає різнокольорові продукти реакції. Крім пероксидази хрону може вживатись глюкозна оксидаза (бактерійний ензим, який відсутній в людських тканинах); проте продукт реакції не такий стабільний або нерозчинний, як пероксидаза. Набуває популярності лужна фосфатаза, особливо при використанні технік з подвійною міткою для одночасного виявлення двох антигенів.

Імуноферментні методи широко використовуються у лабораторній практиці; особливо при імуногістологічних дослідженнях, а також для виявлення циркулюючих антигенів, антитіл та імунних комплексів, які мають суттєве значення в діагностиці інфекційних хвороб.

Розрізняють прямі і непрямі імуноферментні методи.

Прямий метод. На першому етапі реакції антиген реагує з антитілом, міченим пероксидазою, потім до утвореного комплексу додають відповідний субстрат (наприклад, Н₂0₂, 5-аміносаліцилову кислоту). Якщо антиген відповідає антитілу, в реагуючій системі виникає певне забарвлення. Методика постановки проста, проте така реакція вживається рідко з приводу меншої чутливості порівняно з іншими методами.

Непрямий метод. Спочатку антиген реагує з неміченими антитілами, утворюючи комплекс антиген - антитіло. Після промивання у систему вносять протиглобулінові антитіла, мічені пероксидазою, які зв'язуються з першим комплексом. Після наступного промивання вносять субстрат, який, розкладаючись адсорбованим ферментом, зумовлює появу відповідного забарвлення.

Описано різноманітні модифікації техніки непрямого методу. Перші антитіла можуть бути мічені гаптенами, якими є біотин або арсенілова кислота, інші спрямовані проти гаптена, кон'юговані з пероксидазою.

Для маркування реагентів реакції широко використовують можливості системи авідин-біотин. Авідин - глікопротеїн білка курячого яйця, має 4 детермінанти, які зв'язують вітамін біотин. Тому авідин, як і біотин, можна використовувати для мітки антитіл або ензимів (також для інших маркерів, таких як флуоресцеїн або лектин).

Техніка подвійної мітки. Твердофазні імуноферментні методи Конкурентний твердофазний метод.

До радіоімунних методів відносяться всі імунологічні методи, в яких застосовують мічені радіоактивними ізотопами антигени або антитіла.Для радіоактивного мічення найчастіше використовують два нукліди: тритій -³Н і йод – ^{125 J}. Радіоактивність заміряють з допомогою лічильників у-проміння, в яких кількість імпульсів є показником концентрації міченого антигена чи антитіла. Використовують також авторадіографію.

Класична радіоімунна методика базується на використанні конкурентного зв'язування антитілами досліджуваного антигена і міченого ізотопом антигена, який вносять у конкретну пробу в тій же самій кількості. Чим більша кількість досліджуваного антигена, тим менше міченого антигена зв'язується з антитілами.

Принцип конкурентного РІМ полягає в тому, що спочатку антитіло, розміщене на твердій фазі, інкубують з досліджуваним матеріалом, в якому визначають антиген, потім додають мічений ізотопом стандартний антиген. При наявності в матеріалі специфічного антигена в меншій мірі буде зв'язуватись з антитілом мічений антиген, на що буде вказувати низька радіоактивність у пробі.

Метод " сендвіча" також використовується для дослідження антигенів. У даному випадку антитіло, адсорбоване на твердій фазі, реагує з антигеном. До утвореного комплексу додають специфічне антитіло з радіоактивною міткою, яке зв'язується з антигеном. Кількість міченого антитіла прямо залежить від кількості зв'язаного антигена. Ця модифікація РІМ може застосовуватись для вивчення антигенів, які мають мінімум дві детермінанти, що здатні реагувати з антитілом.

Аналогічна методика може бути використана і для дослідження антитіл. Тоді антиген адсорбують на твердій фазі, вносять досліджувану сироватку і мічений антиген. Кількість зв'язаного міченого антигена є пропорційною кількості досліджуваних антитіл.

39. Вакцини, класифікація. Корпускулярні. Вакцини – антигенні препарати, виготовлені із МіО їх антигенів, токсинів, використ для активної імунізації людей і тварин із профілактичною або лікувальн метою. За походженням: 1. із живих МіО –живі, ін активовані, 2. вакцини з АГ МіО –хімічні, ізбединічні, 3. анатоксини. За кількісним і якісним складом: 1. моно- ди- три-вакцини – з одного, двох трьох компонентів однакового походження (напр. вірусів), 2. асоційовані – із препаратів різного походження (напр. ін активованих вакцин і анатоксинів), 3. аутовакцини- із власних збудників, викор найчастіше для стимуляції імунітету і лікування (гоновак-при гонореї, стафілококова - при хронічних запаленнях).