Иммобилизованные ферменты. В последние 15–20 лет на стыке ряда химических и биологических

В последние 15–20 лет на стыке ряда химических и биологических

дисциплин сложилось новое " инженерное" направление – химическая

энзимология, стремительное развитие которой было обусловлено

созданием

биологических

катализаторов

нового

типа

–

иммобилизованных ферментов. А разработка метода иммобилизованных

ферментов определялась, в свою очередь, рядом существенных факторов,

затрудняющих использование чистых ферментов во многих

промышленных производствах.

Во-первых, чистые препараты ферментов неустойчивы при

длительном хранении, а также при разного рода воздействиях, особенно

тепловых.

Во-вторых, в виду сложности отделения ферментов от различных

реагентов смеси многократное их использование весьма затруднено.

Однако принципиально новые перспективы открылись перед прикладной

энзимологией с разработкой принципов создания иммобилизованных

ферментов. Иммобилизованные ферментные препараты обладают рядом

существенных преимуществ при использовании в прикладных

(промышленных целях) производствах по сравнению с чистыми

препаратами. Гетерогенный (иммобилизованный) катализатор легко

отделить от реакционной среды, что обусловливает:

• возможность остановки реакции в любой нужный момент;

• повторное использование катализатора;

• получение конечного продукта, не загрязненного ферментом.

Последний момент весьма важен при производстве пищевых и

медицинских продуктов. Применение иммобилизованного катализатора

позволяет проводить ферментный процесс непрерывно и регулировать

скорость реакции, а также изменять количество получаемого продукта в

соответствии с изменениями скорости протока реакционной смеси.

Иммобилизация или некоторая модификация фермента может обусловить

изменения и некоторых его свойств (специфичность взаимодействия с

субстратом; зависимость каталитической активности от рН, ионного

состава и других параметров среды, а также его стабильность по

отношению к различного рода денатурирующим воздействиям).

Иммобилизация ферментов дает возможность регулировать их

каталитическую активность за счет изменения свойств носителя.

Для иммобилизации ферментов используются также различные типы

неорганических носителей, таких, как создаваемые на основе силикагеля,

глины, керамик, природных минералов, металлов и их оксидов.

Основными

качествами,

определяющими

широкое

внедрение

неорганических носителей в производственные процессы, является

легкость их регенерации и возможность придания им любой

конфигурации. Они могут применяться как в виде порошков, шариков, так

и монолитов; они могут быть как пористыми, так и сплошными

(непористыми).

Определенное преимущество для различного рода работ имеют

носители, приготавливаемые на основе микропористых кремнеземов. К их

достоинствам следует отнести механическую прочность, химическую

инертность по отношению ко многим растворителям, наличие жесткого

скелета с заданным размером пор, а также устойчивость к

микроорганизмам. Недостатками кремнеземов является их использование

в ограниченном диапазоне рН, а также явление неспецифической сорбции

на их поверхности, хотя последнее может быть устранено различными

модифицирующими воздействиями. Правда, стоимость кремнеземных

носителей относительно высока, и модификация еще больше повышает

цену, поэтому внедрение их в промышленность существенно ограничено.

Более пригодными для промышленного использования могут

оказаться природные алюмосиликаты – глины, а также пористая керамика,

в состав которой, помимо алюмосиликатов, входят окислы титана,

циркония или другие добавки. Следует также упомянуть такие широко

распространенные носители, как уголь и графитированная сажа. Весьма

перспективными носителями являются приготавливаемые на основе

металлов и их оксидов, которые характеризуются высокой механической

прочностью, относительной дешевизной, стабильностью и хорошими

гидродинамическими свойствами.

Иммобилизация представляет собой включение фермента в такую

среду, в которой для него доступной оказывается лишь ограниченная

часть общего объема. На практике для иммобилизации ферментов

используют рутинные физические и химические методы. Все

существующие методы физической иммобилизации (т. е. иммобилизации,

при которой фермент не соединяется с носителем ковалентными связями)

могут быть подразделены на четыре основные группы:

• адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (или как

иногда говорят матрикса);

• включение в поры геля;

• пространственное разделение фермента от остальной части

реакционной смеси с помощью полупроницаемой мембраны;

• введение фермента а двухфазную реакционную среду, в которой он

растворим, но может находиться только в одной из фаз.

Как и всякая другая классификация, приведенная ниже, является в

значительной степени условной, так как не всегда существует

возможность проведения четкой границы между различными способами

иммобилизации.

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из всех

существующих в настоящее время способов иммобилизации ферментов.

Носителями при данном способе иммобилизации могут быть как

органические, так и неорганические вещества, которые применяются а

виде порошка, мелких гранул или шариков. Иммобилизация ферментов

путем

адсорбции

на

нерастворимых

носителях

отличается

исключительной простотой и достигается путем обеспечения контакта

водного раствора фермента с избранным для конкретной цели носителем.

После отмывки неадсорбированного фермента препарат готов к

применению.

На процесс адсорбции и прочность связывания фермента с носителем

оказывают определенное влияние различные факторы внешней среды,

основными из которых являются: удельная поверхность и пористость

носителя, значения рН среды, ионная сила раствора фермента, его

концентрация, а также температура проведения адсорбции. Иными

словами, эффективность иммобилизации ферментов определяется

сбалансированностью ряда факторов и нарушение этого баланса может

привести к резкому ослаблению взаимодействия фермента с носителем.

Для исключения подобной ситуации, на практике используется набор

методических приемов, способствующих повышению эффективности

процесса и, следовательно, получению более качественных препаратов.

Иммобилизация путем включения в гели состоит в том, что молекулы

фермента включаются в трехмерную сетку, образованную тесно

переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство

между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой

приходится обычно значительная часть общего объема геля. Для

иммобилизации фермента в геле существует два основных способа:

• при одном из них фермент вводится в водный раствор мономера, а

затем уже проводят полимеризацию, в результате которой

формируется гель с включенными в него молекулами фермента,

• второй способ состоит в том, что фермент вносится в раствор уже

готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в

требуемое состояние, гелеобразное состояние.

Иммобилизация путем включения в полупроницаемые мембраны –

состоит в том, что водный раствор фермента отделяется от водного

раствора субстрата полупроницаемой мембраной, способной легко

пропускать небольшие молекулы субстрата, задерживая крупные

молекулы фермента. Существующие модификации этого метода

различаются лишь способами получения полупроницаемых мембран и их

природой.

К этим модификациям относятся: микрокапсулирование в замкнутых

сферических пузырьках, имеющих тонкую полимерную стенку

(мембрану).

Метод двойного эмульгирования, в соответствии с которым

приготовленная заранее эмульсия водного раствора фермента в

органическом растворе полимера вновь диспергируется в воде. После

затвердевания органического раствора образуются полимерные

сферические частицы с иммобилизованными в них молекулами фермента.

Способ

включения

в

волокна

отличается

от

метода

микрокапсулирования главным образом формой получаемых препаратов.

Если при микрокапсулировании образуются сферические микрокапсулы,

то при этом способе формируются нити. Для иммобилизации ферментов

можно использовать также выпускаемые промышленностью полимерные

полые волокна, изготавливаемые из природных или синтетических

материалов. Для проведения ферментативной реакции волокна, по

которым циркулирует раствор фермента, погружаются в сосуд с

раствором субстрата, диффундирующим через мембрану внутрь волокна.

В медицинских целях и некоторых фундаментальных исследованиях

достаточно широко используется метод иммобилизации ферментов путем

их включения в липосомы, поскольку такие системы близки природным

мембранам и могут дать весьма ценную информацию о ферментативных

процессах, протекающих в клетках. Существует несколько модификаций

данного способа, самой последней из которых является иммобилизация

путем включения в полимерные липосомы. Полимерные липосомы

характеризуются более высокой стабильностью по сравнению с

обычными.

Основным недостатком всех мембранных систем, применяемых для

иммобилизации ферментов, является невозможность ферментативного

превращения высокомолекулярных субстратов, для которых мембраны

представляют собой непреодолимые барьеры.

Иммобилизация ферментов с использованием систем двухфазного

типа сводится к тому, что ограничение свободы перемещения фермента в

системе достигается не вследствие его фиксирования на жестком

носителе, а в результате его способности растворяться только в одной из

фаз двухфазной системы.