Ферментные системы клеток и отдельные ферменты.

Основой большинства современных биотехнологических производств

до сих пор все еще является микробный синтез, т. е. синтез разнообразных

биологически активных веществ с помощью микроорганизмов. К

сожалению, объекты растительного и животного происхождения в силу

ряда причин еще не нашли столь широкого применения.

Независимо от природы объекта, первичным этапом разработки

любого биотехнологического процесса является получение чистых

культур организмов (если это микробы), клеток или тканей (если это

более сложные организмы – растения или животные). Многие этапы

дальнейших манипуляций с последними (т.е. с клетками растений или

животных), по сути дела, являются принципами и методами,

используемыми в микробиологических производствах. И культуры

микробных клеток, и культуры тканей растений и животных с

методической точки зрения практически не отличаются от культур

микроорганизмов. Поэтому дальнейшие рассуждения целесообразно вести

применительно к микробиологическим объектам.

Мир микроорганизмов крайне разнообразен. В настоящее время

относительно хорошо охарактеризовано (или известно) более 100 тысяч

различных их видов. Это в первую очередь прокариоты (бактерии,

актиномицеты, риккетсии, цианобактерии) и часть эукариот (дрожжи,

нитчатые грибы, некоторые простейшие и водоросли). При столь большом

разнообразии микроорганизмов весьма важной, а зачастую и сложной,

проблемой является правильный выбор именно того организма, который

способен обеспечить получение требуемого продукта, т. е. служить

промышленным целям. Разделение микроорганизмов на промышленные и

непромышленные для лиц, далеких от микробиологии, молекулярной

биологии и молекулярной генетики, кажется достаточно определенным:

те микроорганизмы, которые используются в промышленном

производстве – промышленные, а те, которые не используются, –

непромышленные.

Однако для тех, кто близко соприкасается с вышеперечисленными

отраслями биологических

знаний, граница проходит между

немногочисленной, но глубоко изученной группой микроорганизмов,

служащих модельными объектами при исследованиях фундаментальных

жизненных процессов, и всеми остальными микроорганизмами, которые,

как правило, генетиками, молекулярными биологами и генными

инженерами не изучались совсем или изучались в очень ограниченной

степени. К числу первых относятся кишечная палочка (E. coli), сенная

палочка (Bac. subtilis) и пекарские дрожжи (S. cerevisiae).

Во

многих

биотехнологических

процессах

используется

ограниченное число микроорганизмов, которые классифицируются как

GRAS («generally recognized as safe» обычно считаются безопасными). К

таким микроорганизмам относят бактерии Bacillus subtilis, Bacillus

amyloliquefaciens, другие виды бацилл и лактобацилл, виды Streptomyces.

Сюда также относят виды грибов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus

и дрожжей Saccharomyces и др. GRAS-микроорганизмы непатогенные,

нетоксичные и в основном не образуют антибиотики, поэтому при

разработке

нового

биотехнологического

процесса

следует

ориентироваться на данные микроорганизмы, как базовые объекты

биотехнологии.

Микробиологическая промышленность сегодня использует тысячи

штаммов из сотен видов микроорганизмов, которые первично были

выделены из природных источников на основании их полезных свойств, а

затем (в большинстве своем) улучшены с помощью различных методов. В

связи с

расширением производства и ассортимента выпускаемой

продукции в микробиологическую промышленность вовлекаются все

новые и новые представители мира микробов. Следует отдавать себе

отчет, что в обозримом будущем ни один из них не будет изучен в той же

степени, как E.coli и Bac.subtilis. И причина этого очень простая –

колоссальная трудоемкость и высокая стоимость подобного рода

исследований.

Следовательно, возникает проблема разработки стратегии и тактики

исследований, которые обусловили бы с разумной затратой труда извлечь

из потенциала новых микроорганизмов все наиболее ценное при создании

промышленно

важных

штаммов-продуцентов,

пригодных

к

использованию в биотехнологических процессах.

Классический подход заключается в выделениинужного

микроорганизмаизприродныхусловий.

Из естественных мест обитания предполагаемого продуцента

отбирают образцы материала (берут пробы материала) и производят посев

в элективную среду, обеспечивающую преимущественное развитие

интересующего микроорганизма, т. е. получают так называемые

накопительные культуры.

Следующим этапом является выделение чистой культуры с

дальнейшим

дифференциально-диагностическим

изучением

изолированного микроорганизма и, в случае необходимости,

ориентировочным определением его продукционной способности.

Существует и другой путь подбора микроорганизмов-продуцентов –

это выбор нужного вида из имеющихся коллекций хорошо изученных и

досконально охарактеризованных микроорганизмов. При этом,

естественно, устраняется необходимость выполнения ряда трудоемких

операций.

Главным критерием при выборе биотехнологического объекта (в

нашем случае микроорганизма-продуцента) является способность

синтезировать целевой продукт. Однако помимо этого, в технологии

самого процесса могут закладываться дополнительные требования,

которые порой бывают очень и очень важными, чтобы не сказать

решающими. В общих словах микроорганизмы должны:

• обладать высокой скоростью роста;

• утилизировать необходимые для их жизнедеятельности дешевые

субстраты;

• быть резистентными к посторонней микрофлоре, т. е. обладать

высокой конкурентоспособностью.

Все вышеперечисленное обеспечивает значительное снижение затрат

на производство целевого продукта. Конечно, в каждом конкретном

случае ведущим является какой-то один из этих критериев, поскольку в

природе устроено так, что во всем получить выигрыш не удается никогда.

И это правило необходимо постоянно иметь в виду. Ниже приводятся

примеры, имеющие своей целью проиллюстрировать ранее сказанное.

1.Одноклеточные организмы, как правило, характеризуются более

высокими скоростями роста и синтетических процессов, чем

высшие организмы. Тем не менее это присуще не всем

микроорганизмам. Существуют такие из них (например,

олиготрофные), которые растут крайне медленно, однако они

представляют

известный

интерес,

поскольку

способны

продуцировать различные очень ценные вещества.

2. Особое внимание как объекты биотехнологических разработок

представляют фотосинтезирующие микроорганизмы, использующие

в своей жизнедеятельности энергию солнечного света. Часть из них

(цианобактерии и фотосинтезирующие эукариоты) в качестве

источника углерода утилизируют СО₂, а некоторые представители

цианобактерий, ко всему сказанному, обладают способностью

усваивать атмосферный азот (т. е. являются крайне неприхотливыми

к питательным веществам). Фотосинтезирующие микроорганизмы

перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и ряда

органических соединений. Однако пpoгpecca в их использовании

вследствие ограниченности фундаментальных знаний об их

генетической

организации

и

молекулярно-биологических

механизмах жизнедеятельности, по всей видимости, следует

ожидать не в скором будущем.

3. Определенное внимание уделяется таким объектам биотехнологии,

как термофильные микроорганизмы, растущие при 60–80° С. Это их

свойство является практически непреодолимым препятствием для

развития посторонней микрофлоры при относительно не

стерильном культивировании, т. е. является надежной защитой от

загрязнений. Среди термофилов обнаружены продуценты спиртов,

аминокислот, ферментов, молекулярного водорода. Кроме того,

скорость их роста и метаболическая активность в 1, 5–2 раза выше,

чем у мезофилов.

Ферменты,

синтезируемые

термофилами,

характеризуются

повышенной устойчивостью к нагреванию, некоторым окислителям,

детергентам, органическим растворителям и другим неблагоприятным

факторам. В то же время они мало активны при обычных температурах.

Так, протеазы одного из представителей термофильных микроорганизмов

при 20⁰С в 100 раз менее активны, чем при 75⁰С. Последнее является

очень важным свойством для некоторых промышленных производств.

Например, широкое применение в генетической инженерии нашел

фермент Taq-полимераза из термофильной бактерии Thermus aquaticus.

Ранее уже упоминалось о еще одном весьма существенном свойстве

этих организмов, а именно, что при их культивировании температура

среды, в которой они пребывают, значительно превышает температуру

окружающей среды. Данный высокий перепад температур обеспечивает

быстрый и эффективный обмен тепла, что позволяет использовать

биологические реакторы без громоздких охлаждающих устройств. А

последнее, в свою очередь, облегчает перемешивание, аэрацию,

пеногашение, что в совокупности значительно удешевляет процесс.

Селекция. Неотъемлемым компонентом в процессе создания

наиболее ценных и активных продуцентов, т. е, при подборе объектов в

биотехнологии, является их селекция. А генеральным путем селекции

является сознательное конструирование геномов на каждом этапе отбора

нужного продуцента. Такая ситуация не всегда могла быть реализована,

вследствие отсутствия эффективных методов изменения геномов

селектируемых организмов. В развитии микробных технологий в свое

время сыграли (да и сейчас еще продолжают играть!) очень важную роль

методы, базирующиеся на селекции спонтанно возникающих измененных

вариантов, характеризующихся нужными полезными признаками. При

таких методах обычно используется ступенчатая селекция: на каждом

этапе отбора из популяции микроорганизмов отбираются наиболее

активные варианты (спонтанные мутанты), из которых на следующем

этапе отбирают новые, более эффективные штаммы. И так далее.

Несмотря на явную ограниченность данного метода (приема),

заключающуюся в низкой частоте возникновения мутантов, возможности

его рано считать полностью исчерпанными.

Процесс селекции наиболее эффективных продуцентов значительно

ускоряется при использовании метода индуцированногомутагенеза.

В качестве мутагенных воздействий применяются УФ, рентгеновское

и гамма-излучения, определенные химические вещества и др. Однако и

этот прием также не лишен недостатков, главным из которых является его

трудоемкость и отсутствие сведений о характере изменений, поскольку

экспериментатор ведет отбор по конечному результату. Например,

устойчивость организма к ионам тяжелых металлов может быть связана с

подавлением системы поглощения данных катионов бактериальной

клеткой, активацией процесса удаления катионов из клетки или

перестройкой системы (систем), которая подвергается ингибирующему

действию катиона в клетке. Естественно, знание механизмов повышения

устойчивости позволит вести направленное воздействие с целью

получения конечного результата за более короткое время, а также

селектировать варианты, лучше подходящие к конкретным условиям

производства.

Таким образом, тенденцией сегодняшнего дня является