Флавоноидтар мен сапониндердің хроматографиялық әдістері

Белгілі бір еріткіштер жү йесінде арнайы айқ ындағ ыштар (УК - жарық, аммиак буы, ЖАК) қ олданылуы арқ ылы екі жү йелі қ ағ азды хроматография ә дісі агликондар мен гликозидтерді ажыратуғ а, вициналды гидроксилді топтарды (ЖАК-пен жасыл-кө к тү с) айқ ындауғ а мү мкіндік береді. Жеке қ осылыстарды идентификациялау ү шін қ ағ азды хроматографиямен қ атар жұ қ а қ абатты хроматографиясыда қ олданылады.

Қ ағ азды хроматографияның ерекшелігі: кө рінетін ультракү лгін жарық та кө птеген қ осылыстардың табиғ и бояуы, оң ай біліну флаваноидты қ осылыстарды қ ағ азда жең іл тануғ а мү мкіндік береді. Басқ а тә сілмен салыстырғ анда бұ л ә дістің артық шылығ ы жә не оны ауыстыруғ а болмайтындығ ы, оның оң айлығ ында жә не басқ а заттардың микрошамалы заттармен жұ мыс істеу мү мкіндігінде [34].

Қ олданатын заттың хроматограммасы Rf шамасымен анық талады. Бұ л шама зерттелетін заттың жү рген жолының, еріткіш фронты ө ткен жолының қ атынасына тең. Флаваноид қ ұ рылысын Rf шамасының ө згеру шамасы бойынша жорамалдауғ а болады. Ә ртү рлі флаваноидтық қ осылыстардың спирттегі еріткіштердің сулы жү йесіндегі байқ алғ ан заң дылық тары мынадай:

1. Спиртті жү йеде флаваноидтарғ а гликозидтерінің мә ні оғ ан сә йкес болатын агликондар мә нінен тө мен. Сулы жү йеде керісінше, яғ ни гликозидтердің мә ндері олардың олардың агликондарына қ арағ анда жоғ ары.

2. Молекуладағ ы гликозидтің қ ант компонентінің ө су саны еріткіштің спирттік жү йедегі Rf мә нін кемітеді, ал сулы жү йеде ө сіреді.

3. Гидроксил топтарының ө су саны спирттік жә не сулы жү йеде Rf мә нін кемітеді.

4. Гидроксил топтарының метокси топқ а алмасуы спирттік Rf мә нін ө сіреді, ал сулы жү йеде Rf мә нін кемітеді [35].

Жұ қ а қ абатты хроматография флавоноидтардың кү рделі қ оспаларын бө лудің нақ ты ә дістерінің бірі. Жұ қ а қ абатты хроматографияны бө луде полиамид ең кө п қ олданылады, жә не де келесі заң дылық тар қ арастырылады:

1. Флавоноидты гликозидтер агликондарғ а қ арағ анда кү штірек сорбцияланады;

2. Агликондардың сорбциялық белсенділігі гидроксилді топтардың санына ғ ана емес, олардың орналасуына да байланысты болады. 3-ОН тобы 5-ОН тобына қ арағ анда сорбциялануғ а белсендірек. –ОН тобының сорбциялық белсенділігіне байланысты мынадай қ атар қ ұ руғ а болады: 3-OH < 3'-OH, (5'-OH) < 5-OH< 4'-OH < 7-OH

Гликозидтер мен полярлы агликондарды бө лу ү шін метанол-сірке қ ышқ ылы-су (18: 1: 1), су-бутанол-метанол (70: 15: 10) еріткіштер жү йесі сә йкес келеді. Полярсыз жоғ ары метоксилденген полиамидті жазық тық та агликондарды препараттық бө луде еріткіштер жү йесі ретінде толуол-бензол- метанол (30: 90: 1, 5) қ олданылады.

Изофлавоноидтарды анық тау ү шін еріткіштер жү йесі ретінде қ олданылады: Na₂CO₃ –СН₃СООН-HCI- Н₂О (3: 6: 1: 1), изопропанол-су (3: 2; 22-78; 1: 3), сірке қ ышқ ылы-су (10-60%). Метокси тобы кө п кездесетін кейбір изофлавондар ү шін полярсыз еріткіштер жү йесі қ олданылады: бензол-лигроин-метанол-су (50: 50: 1: 50), хлороформ- лигроин-метанол-су (2: 1: 7: 5).

Зерттелетін шикізатта флавоноидтарды алдын-ала анық тау ү шін тү сті реакциялар қ олданылады.

Полифенолды қ осылыстар комплекс тү зуші жә не диазоттау реакциясына тү седі. 1%-ды алюминий хлоридімен реакциясы

Флавондарды, халкондарды, изофлавондарды жә не аурондарды анық тауғ а мү мкіндік береді; флавондар сары тү ске, халкондар қ ызыл тү ске, изофлавондар қ оң ыр-сары тү ске, ал аурондар қ ызғ ылт-сары тү ске боялады. Флаваноидтардың аммиак буында айқ ындалуы арнайы сапалық реакция емес, кө рсеткіш реакция болады, себебі, кумариндер, антрахинондар жә не т.б. карбонилді қ осылыстар айқ ындалады. Флаваноидтарғ а арнайы сапалық реакция «антоциоанды сынама» болады – тұ з қ ышқ ылы қ атысындағ ы магниймен тотық сыздану реакциясы, бұ л кезде қ ызғ ылт-сарыдан шие-қ ызыл тү ске дейін боялғ ан флавил тұ здары – антоцианиндер тү зіледі [36].

Сапониндердің жалпы санын тазалаудың кең інен таралғ аны – хроматографиялық ә дістер. Қ ұ рамында карбоксилді топтары бар гликозид ілеспелі заттардан, сонымен бірге минералды қ оспалардан ионалмастырғ ыш хроматография арқ ылы бө ле алады. Сапониндердің жалпы санын хроматографиялық тазалауды алюминий оксидінде, силикагельде, белсендірілген кө мірде жү ргізеді.

Табиғ и қ осылыстардың (амин қ ышқ ылдары, кө мірсулар жә не т.б.) басқ а да кластарынан сапониндер ү шін ерекшелігі элюирлеудің ә мбебап жү йесі жоқ. Бейтарап сапониндер ү шін кө бірек келетін жү йелер:

· н -бутил спирті – этил спирті – су;

· н -бутил спирті – сірке қ ышқ ылы – су (ә ртү рлі қ атынастарда, жоғ ары қ абат);

· хлороформ – метил спирті – су (65: 35: 10).

Хроматограммаларда ө ң деу ү шін сапониндердің тү сті реакцияларын жү ргізгендегі реактивтерді қ олдануғ а болады. Осылайшы, стероидты сапониндерді анық тау ү шін хроматограмманы бірінші 1%-ды SbCl₃ спиртті ерітіндісімен ө ң дейді, сосын кепкеннен кейін Н₂SО₄-ын сірке ангидридімен сары дақ тар тү зеді.

Тритерпенді сапониндерді анық тау ү шін 20%-ды Н₂SО₄ ерітіндісін қ олданады. Хроматограмманы осы ерітіндімен ө ң деген соң t=115-120⁰С температурада 15 минут бойы қ ыздырғ анда кү лгін дақ тар пайда болады. Сонымен бірге SbCl₃-ті SbCl₅ іздерімен қ анық қ ан хлороформ ерітінділерін қ олдануғ а болады, ол тритерпенді сапониндерде қ ызғ ылт-кү лгін тү сті береді.

Басқ а да гликозидтер сияқ ты сапониндер қ ұ рылысын анық тауда агликон мен кө мірсу бө ліктерінің қ ұ рылысы, сонымен қ атар кө мірсу жасаушысының агликонғ а қ осылу тә сілімен орны анық талды [37].

Жұ қ а қ абатт хроматография. Сулы немесе спиртті сығ ындысымен силикагельде немесе алюминий оксидінде сә йкес ерітінділер жү йесінде хроматографиялайды. Бейтарап сапониндерге жиі н -бутанол-сірке қ ышқ ылы-су, қ ышқ ыл сапониндерге н -бутанол-ә р тү рлі қ атынастағ ы сулы аммиакты қ олданады. Жү йені тә жірибе жү зінде алады. Сапониндерді хроматограммада ә ртү рлі қ ышқ ыл реагенттерді концентрлі кү кірт қ ышқ ылы, сірке қ ышқ ылы, сірке ангидриді, 25% фосфорлы молибден қ ышқ ылының ерітіндісі, ү шхлорлы сү рме (сурьма) жә не тағ ы басқ аларды кобальт хлоридінің, ванилиннің, пара-диметиламин-бензальдегид жә не т.б. қ атысында сепкенде анық талады.

Тритерпенді сапониндер қ ызғ ылт немесе қ оң ыр-кү лгін дақ тар тү рінде тү седі.

Стероидты сапониндер хроматограммада 1% ү шхлорлы сү рме ерітіндісі, концентрлі кү кірт қ ышқ ылы жә не сірке ангидридімен сары (спиростанды) дақ тар (Санье реакциясы) береді. Қ азіргі кезде шикізатта сапониндердің бар болуын ең нақ ты – хроматографиялық ә діс кө рсетеді.

Ө сімдік шикізатында сапониндерді анық тау ү шін қ олданылатын реакцияларды ү ш топқ а бө луге болады:

1. сапониндердің физикалық қ асиеттеріне негізделген реакциялар;

2. сапониндердің химиялық қ асиеттеріне негізделген реакциялар;

3. сапониндердің биологиялық қ асиеттеріне негізделген реакциялар.

Бірінші реакциялар тобына кө бік тү зу реакциясын (сынама) жатқ ызуғ а болады. Бұ л тек сезімтал сынама болып қ ана қ оймай, сонымен бірге ө здеріне тә н қ асиет болып келеді, ө йткені ө сімдіктерде мұ ндай кө бік тү зуге қ абілеті бар заттар кездеспейді.

Сапалық реакциялардың екінші тобына сапониндердің тұ ндыру жә не тү сті реакцияларды жатқ ызуғ а болады.

Сапониндер сулы ерітінділерден барий, магний гидроксидтерімен темір тұ здармен, қ орғ асын ацетатымен тұ нбағ а тү седі. Сонымен қ атар тритерпенді сапониндер – орташа, ал стероидты – негізгі қ орғ асын ацетатымен тұ нады.

Спиртті сығ ындыдан (ерітіндіден) стероидты жә не тритерпенді сапониндер холестериннің холестеридтер тү ріндегі спирттік ерітіндісін қ осқ анда тұ нбағ а тү седі.

Жү ректі гликозидтерге тә н стероидты сапониндер Либерман – Бурхард реакциясын береді.

Сапониндердің сапалық реакциясы ү шін, сыйымдылығ ы 100 мл-лік колбағ а 1 г ө сімдік шикізатын салады да, ү стіне 1 мл су қ ұ йып, кері тоң азытқ ышқ а жалғ ап, сулы моншада 10 минут қ ыздырады. Колба суғ аннан кейін ерітіндіні сү зіп алып, қ ыздырады. Ар қ арай сапалық реакцияларды жасауғ а пайдаланылады.

1. Кө біктү зілу (беру) реакциясы. Екі сынауық алып, біреуіне 5 мл 0, 1 н НСl, ал екіншісіне 5 мл 0, 1 н NaOH қ ұ яды. Ә рқ айсысына 2-3 тамшы сығ ынды (алынғ ан экстракт) қ осып, қ атты шайқ айды. Ө сімдік қ ұ рамында тритерпенді сапониндер бар екенін екі сынауық та да кө лемді жә не тұ рақ ты кө біктердің тү зілгенінен байқ ауғ а болады. Егер ө сімдік қ ұ рамында стероидты тобы бар сапониндер болатын болса, онда оны сілтілік ортада тү зілген кө біктердің кө лемі мен тұ рақ тылығ ы жағ ынан бірнеше есе кө птігінен ажыратуғ а болады.

2. Лафон реакциясы. 2 мл сулы сығ ындығ а 1 мл концентрлі кү кірт қ ышқ ылын, 1 мл этил спиртін жә не 1 тамшы 10%-ды темір сульфатының ерітіндісін қ осып, қ ыздырады. Қ ыздырғ ан кезде кө к-жасыл тү с пайда болады.

3. Либерман-Бурхард реакциясы. Бұ л реакцияны жү ргізу ү шін зерттелетін затты сірке қ ышқ ылында (леденая) ерітеді де, ү стіне сірке ангидриді жә не концентрлі кү кірт қ ышқ ылының қ оспасын (50: 1) қ осады. Бірнеше уақ ыттан кейін қ ызғ ылт тү стен жасыл жә не кө к тү ске дейін ө згереді.

4. Эритроциттердің гемолизі. 1 мл изотоникалық ерітіндінің тұ ндырындысына 1 мл 2% эритроциттердің ө лшендісін қ осады. Қ ан мө лдір, ашық қ ызыл тү с береді (гемолиз) [38].