Приготовление питательных сред

Компоненты питательных сред. Для натуральных питательных сред используют животные, растительные и микробные продукты: мясо, рыбную муку, молоко, яйца, кровь, картофель, дрожжи и др. Из них готовят полуфабрикаты: настои и экстракты (мясная вода, дрожжевой экстракт), ферментативные и кислотные гидролизаты (пептон, перевар Хоттингера, перевар казеина и др.). Настои и экстракты являются источником факторов роста; гидролизаты - источником аминокислот и других органических питательных веществ. Минеральные соли вносят в следующих соотношениях: NaCI - 5, 0 г/л; КН2РО4 - 0, 2-0, 5 г/л; MgSO4x7H2О - 0, 1-0, 2 г/л; остальные соли - 0, 001 г/ л. Для специальных сред используют: сахара (глюкозу, лактозу - 0, 5-1, 0%); многоатомные спирты (маннит. инозит и др. - 0, 5-1, 0%); аминокислоты -0, 5-1, 0%; витамины - 0.001 мг/л; кровь - 5-10%; сыворотку крови - 10-30%; молоко и др. Из индикаторов рН чаще применяют индикатор Андреде (0, 5 г кислого фуксина: раствора 1 N NaOH -17 мл; дистиллированной воды -100 мл) или индикатор Кларка (1, 5%) спиртового раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.). В качестве уплотнителя питательных сред используют агар-агар или желатин. Агар-агар - полисахарид, получаемый из морских водорослей, - способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80-86°С и застудневающий при 40-45°С: не расщепляется большинством видов микроорганизмов. Желатин - белок, получаемый из кожи и костей; желатиновый гель плавится при 32-34°С, застудневает при 26-28°С (т.е. при температуре инкубации 37°С находится в жидком состоянии); расщепляется многими видами микроорганизмов. По этому желатин применяют редко.

Этапы приготовления питательных сред. Согласно прописи питательной среды в дистиллированную воду вносят необходимые компоненты и растворяют при нагревании. При разведении белковых гидролизатов концентрация аминного азота должна оставлять 1, 0-1, 2 г/л, общего - 2, 5-3, 0 г/л; рН среды определяют с помощью индикаторных бумажек или электропотенциометров (с учетом того, что после стерилизации рН среды снизится на 0, 2). Фильтруют жидкие и желатиновые среды через (фильтровальную бумагу; среды с агаром (в горячем состоянии) - через ватно-марлевый фильтр. При необходимости осветляют питательную среду обработкой белком куриного яйца, сывороткой или осаждением. Разливают среду в колбы, флаконы, пробирки. Используют чистую нестерильную посуду, если среда подлежит стерилизации при 120°С. или стерильную посуду, если среда требует стерилизации текучим паром (100°С), или при 112°С. Закрывают посуду со средой ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зависимости от состава среды стерилизуют различными способами. Агаровые среды, не содержащие углеводов и нативного белка, а также синтетические среды стерилизуют в автоклаве при 115-120°С в течение 15-20 мин. Среды, содержащие углеводы, молоко, желатин, стерилизуют текучим паром при 100°С дробно или в автоклаве при 112°С в течение 15 мин. Среды, содержащие нативный белок, мочевину, стерилизуют фильтрованием или добавляют стерильные компоненты (кровь, сыворотку и др.) в стерильную основу среды. Готовые стерильные питательные среды подвергают контролю на стерильность путем выдерживания в термостате при 37°С в течение 1-3 сут.

В полевых условиях проще готовить питательные среды из сухих (консервированных) питательных сред. Навеску сухой среды, указанную на этикетке, вносят в дистиллированную или водопроводную воду и кипятят до полного растворения порошка. Затем разливают среду в стерильные колбы, пробирки и стерилизуют. Некоторые среды (например, Эндо, Плоскирева, Левина) можно использовать без стерилизации.